轮状病毒感染肠上皮细胞激活宿主先天免疫研究进展

程明扬，鲁逸远，曾 艳，石春卫，叶丽萍，王春凤，曹 欣

(吉林农业大学动物医学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林长春 130118)

轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属，是一种无囊膜、20面体结构、由三层同心衣壳蛋白包裹的dsRNA病毒。尽管10多年前全球开始接种疫苗，但在一些发展中国家，RV感染每年仍造成超过20万人死亡[1]。不仅如此，RV还感染仔猪、犊牛、羔羊等幼畜禽，诱发致死性病毒性腹泻，给养殖业带来巨大的经济损失。先天免疫是机体在种系发生和进化过程中，逐渐形成的一种防御功能，构成抵御病原微生物入侵的第一道防线。而肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC)作为RV感染的主要靶点能够很好地调节宿主对感染的最初反应，其主要通过胞内模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)区分“非己”病原体，激活先天免疫应答。

迄今为止，模式识别受体主要为5大家族，分别为Toll样受体家族(TLRs)，RIG样受体家族(RLRs)，NOD样受体家族(NLRs)，C型凝集素样受体家族(CLRs)以及AIM2样受体家族(ALRs)，另外还有细胞核中DNA识别受体 cGAS[2]。

对于RV的主要先天免疫反应之一依赖于在这些PRR的激活，RVs-dsRNA最初由肠细胞或天先天免疫细胞(包括巨噬细胞、树突状细胞)中的TLR3、NLRP9b、RIG-Ⅰ和MDA-5激活下游信号分子产生多种细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IL-8、IL-15、TNF-α、TGF-β和GM-CSF，并且协同上百个IFN依赖基因的表达使宿主建立一个强大的抗病毒状态。

干扰素(interferon,IFN)分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型IFN(IFN-α/β)被13个基因编码，多来源于肠道固有层免疫细胞；Ⅲ型IFN(IFN-λ)被4个基因编码，可能来源于CD45+T淋巴细胞，其受体表达于IEC表面[3]。国内外对IFN限制RV感染做了大量的工作，各项研究都证明Ⅰ型IFN可产生于多种细胞参与宿主抗RV反应，而Ⅲ型IFN主要在肠道中阻断RV复制。

本文就RV感染IEC，被胞内TLR3、RIG-Ⅰ、MDA-5、NLRP9b识别并激活信号级联，诱导IFN和炎性因子的产生进行综述，描述肠道中既独立存在而又相互依赖的先天免疫信号网络。

1 轮状病毒简述

1.1 病原学特征

RV在电镜下呈现车轮状；完整病毒颗粒直径约为65 nm～75 nm，缺损病毒颗粒直径约为50 nm。根据中间衣壳蛋白VP6的抗原差异性，可将其分为(A-J)10种类型(其中A组轮状病毒是引起婴幼儿和幼畜禽病毒性腹泻的关键人畜共患病原)。至今已在人类和动物中确立了32个G基因型(由结构蛋白VP7决定)和47个P基因型(由结构蛋白VP4决定)[1]。其在18℃～20℃条件下可存活7个月，在56℃条件下可以存活1h。RV主要通过粪-口途径传播，感染回肠绒毛上皮细胞，复制和组装发生在细胞质病毒工厂中，新生的RV通过细胞裂解或高尔基非经典囊泡转运从感染细胞中释放。

RV基因组由11个分节段双链RNA构成，全长约为0.6 kb～3.3 kb共编码6个结构蛋白(VP1～4、VP6、7)和6个非结构蛋白(NSP1～6)。其中第11段长度最短的RNA编码2个非结构蛋白NSP5和NSP6。编码蛋白通过与宿主细胞表面分子互作可分为两条入侵途径，即直接入侵与内吞入侵。在RV内化后，外衣壳释放病毒棘突蛋白VP4和VP7与细胞受体结合，并产生一个转录活性的双层颗粒[4]。病毒基因组的11个片段被转录，指导结构蛋白和非结构蛋白的合成，并作为基因组RNA互补链的模板。

1.2 编码蛋白主要功能

1.2.1 结构蛋白 VP1定位于病毒内层，组装病毒所必须的聚合酶；VP2编码内层颗粒蛋白；VP3编码鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性，使病毒粒子mRNA成熟，并且可通过降解2-5As对抗RNaseL抗病毒反应，也可抑制哺乳动物线粒体抗病毒蛋白(mitochondrial antiviral-signaling protein，MAVS)活性，阻断Ⅲ型IFN的产生[5]；VP4在胰蛋白酶的作用下，可将双层颗粒结构裂解为VP5与VP8，VP5含有病毒融合功能区域，参与病毒入侵细胞，VP8主要在黏附宿主细胞中发挥作用；VP6编码病毒内衣壳蛋白，维持病毒形态；VP7同VP4共同组成最外层衣壳蛋白，可在感染宿主体内引起免疫应答，产生轮状病毒特异性抗体。

1.2.2 非结构蛋白 NSP1参与病毒基因组复制和对先天免疫的拮抗。在蛋白酶体的作用下降解IRF3、5、7来下调炎性因子水平和限制Ⅰ型IFN的产生；或抑制STAT1磷酸化，阻断Ⅰ/Ⅲ型IFN反应；还可以募集宿主Cullin-E3连接酶复合物来降解β-TrCP和通过与TRAF2互作干扰NF-κB信号通路转导[6]。某些毒株的NSP1可以诱导凋亡细胞因子P53降解；也可能阻止RIG-Ⅰ-MAVS信号转导。NSP1与宿主互作是通过多种机制实现的，其还会以何种形式阻碍抗病毒先天免疫仍有待进一步探索。NSP2是组成病毒池关键蛋白；NSP3可关闭宿主细胞mRNA翻译，在病毒形态、基因组复制以及逃逸宿主先天免疫发挥作用。此外，有研究表明NSP3通过C末端结构域识别结合eIF4G,使PABP和poly(A)在细胞核内聚集，阻碍IFN的转录翻译；NSP4编码RV的肠毒素蛋白，影响病毒致病性，参与对宿主细胞形态以及钙稳态作用。NSP5、NSP6参与病毒的转录与复制。

1.3 轮状病毒致腹泻机制

RV感染所导致的腹泻主要有两种机制，一种是由于IECs损伤以及死亡诱发的渗透性腹泻，另一种是NSP4产生肠毒素诱发的分泌性腹泻。RV的感染和复制会造成IECs的空泡化，单核细胞浸润，肠绒毛萎缩，导致肠上皮吸收功能下降，肠腔内碳水化合物聚积不能被有效吸收，渗透压过高，发生渗透性腹泻；NSP4分泌的肠毒素刺激肠绒毛，通过磷脂酶C发出信号，上调胞浆中Ca2+水平，从而激活钙依赖性氯通道，Cl-分泌过多导致肠腔内形成渗透梯度，大量水进入肠腔，发生分泌性腹泻。除此之外NSP4还可以刺激肠嗜铬细胞释放神经递质5-羟色胺(5-HT)，调节胃肠蠕动，引起恶心和呕吐[1]。

2 轮状病毒感染激活先天免疫应答

2.1 抗病毒酶参与先天免疫应答

dsRNA依赖性蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白酶，可识别dsRNA病毒，病毒RNA片段被PKR识别捕获并导致自身分子构象发生变化,形成二聚体进入活化状态。活化的PKR分子催化其底物eIF-2α第51位点的丝氨酸磷酸化,削弱eIF-2α分子活性[7]。eIF-2α分子活性降低使侵入胞内的病毒mRNA翻译或蛋白合成受阻。后经证明宿主先天免疫系统清除RV并非通过此途径实现[8]。不过随后的一项研究表明PKR基因缺失小鼠早期感染UK株并不影响下游干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的表达且能调节IFN-β水平，证明其参与干扰素信号转导并对转录后的IFN-β具有调控作用[9]。另外，2′-5′寡腺苷酸合成酶也可识别RV-dsRNA致使自身活化，启动RNase L抗病毒反应促进宿主细胞凋亡和病毒RNA降解[10]。

2.2 TLR介导的抗RV先天免疫应答

TLR3多表达于IECs内体和溶酶体中，是TLRs中首个被证实唯一不使用MyD88作为接头蛋白的dsRNA病毒识别受体。在IL-15的中介作用下，IECs中TLR3信号异常会诱发黏膜损伤。不仅如此，TLR3识别RV激活RAE1表达，通过与上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)上NKG2D受体互作破坏肠上皮；先天免疫细胞CD3+NK1.1+CD8αα+IELs同样也参与上皮内稳态的破坏[11]。很长时间以来，RV感染IECs产生IFN-β被认为是TLR3-TRIF依赖途径介导的。病毒dsRNA片段进入内体后被TLR3识别，由于TLR3同源结构结合域作用，募集到诱导β干扰素TIR结构蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)，形成信号复合物[12]。一方面结合肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3)，激活非典型蛋白激酶IKKi、TBK1诱导IRF3/7 C末端区域发生特异性丝氨酸残基磷酸化，转位入核产生Ⅰ型IFN。另一方面TRIF N末端结合TRAF6而C末端结合RIP1进而激活典型激酶IKKα、IKKβ诱导产生炎性因子NF-κB，激活潜在APCs，启动抗病毒先天免疫应答。后经证实TLR3-TRIF的缺失并不干扰IFN-β的产生并且对RV的增殖与排泄无明显影响，不过TLR3的缺失可能有助于RV的复制，说明TLR3介导的途径主要造成IECs的炎性反应。Pott J等研究发现TLR3能诱导具有年龄依赖性的IFN-Ⅲ，可抑制成年小鼠中RV复制[13]。虽然TLR3信号通路并非通过MyD88活化下游信号分子，但是Uchiyama R等发现Myd88基因敲除小鼠对RV感染的易感性增加并且产生显著降低的RV特异性IgA，这一研究表明庞大的TLR信号转导可驱动先天免疫与适应性免疫并将二者紧密地结合起来[14]。

2.3 RLR介导的抗RV免疫应答

RLRs是继TLRs之后新发现的抗病毒先天免疫途径，其家族成员包括RIG-Ⅰ和MDA-5两者同属DExD/H盒RNA解旋酶，定位在细胞浆中，可识别dsRNA病毒，在抗病毒先天免疫中发挥重要作用。人类RIG-Ⅰ与MDA-5结构类似，编码925个氨基酸的蛋白质，其中包含一个N末端区域，存在两个caspase募集域(CARD)和一个C末端区域，具有潜在的ATP依赖性RNA螺旋酶活性。另外还有一位具有调节作用的成员LGP2，只存在识别结构域而没有结合域，因此不能结合下游接头蛋白MAVS诱导IFN信号转导。当LGP2过表达时可抑制IFN-β产生，是RIG-Ⅰ/MDA-5诱导的抗RV先天免疫应答的负调节因子。然而，在LGP2基因缺失小鼠的一项研究表明，该分子可能根据病毒和宿主细胞的类型差异作为RLR信号通路的正调节因子。

RIG-Ⅰ/MDA-5通过表面含有可结合RNA碱基的C端的识别结构域来结合dsRNA、poly(I∶C)。RIG-Ⅰ可识别较短dsRNA片段(约1.2 kb～1.4 kb)与5′ppp dsRNA；MDA-5可识别较长dsRNA片段(约3.4 kb)。结合后依赖RAC GTRASE酶活性与ATP水解产生的能量诱导RNA解旋，使N端两个相连的半胱天冬酶激活募集域活化，同时导致两者构象发生变化。此时RIG-Ⅰ/MDA-5包裹病毒dsRNA进入线粒体内膜上，通过同源结构域作用募集MAVS并与之结合发生自身寡聚化形成蛋白复合物。与TLR3介导的信号通路类似,蛋白复合物会激活相关激酶(IKKi、TBK1、IKKα、IKKβ),诱导转录因子IRF3/7与IκB二聚化和核移位，促Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型IFN以及促炎因子NF-κB的产生[15]。NF-κB可以促进IL-8的分泌，发挥细胞增殖和上皮修复的功能。被感染的细胞通过自分泌和旁分泌途径激活抗病毒信号级联，Ⅰ型IFN与胞膜上异源二聚体-干扰素受体IFNAR(由IFNR1与IFNR2两个亚基组成)结合，而Ⅲ型IFN是与特定受体IFNLR(IFN-λ受体链1与共享IL-10受体链2)结合，当这两种干扰素受体都缺失时，宿主抗病毒能力会大大减弱[16]。IFNAR、IFNLR释放出几乎相同的信号，与TYK2和JAK1蛋白结合，通过酪氨酸磷酸化作用诱导下游的STAT1和STAT2磷酸化形成二聚体，并与IRF9形成一种异源三聚体转录复合物ISGF3。活化的ISGF3复合体随后转移到细胞核中，特异性的受到干扰素刺激反应原件ISRE(IFN-stimulatory response element，ISRE)调节。ISRE可以调节大多数Ⅰ型IFN诱导基因和少数Ⅱ型IFN诱导基因的表达。STAT1的活化和ISGs的表达也被发现依赖于3型先天淋巴细胞(innate lymphoid cells 3,ILC3)分泌的IL-22与Ⅲ型IFN协同作用。Broquet等在感染SA11株的MAVS基因缺失鼠血清中没有检测到IFN-β并且其粪便中存在较高水平病毒滴度，表明RLR-MAVS是介导IFN-β的主要途径[8]，在MAVS基因缺失的巨噬细胞感染RRV的研究上也得到类似的结论，抗病毒因子被极大的限制[17]。Ding S等发现轮状病毒VP3入侵定位于线粒体，并介导MAVS富含脯氨酸区域内SPLTSS基序磷酸化，导致其蛋白酶体降解并阻断被感染的IECs产生 IFN-λ[5]。这些结果都强调了MAVS在拮抗RV方面的重要性。Sen A通过建立一种RV早期感染模型，用UK株分别感染成纤维胚胎细胞(MEFs)6 h和16 h，发现MDA-5的mRNA表达量都要比RIG-Ⅰ mRNA表达量显著上调[9]。由于RIG-Ⅰ能识别没有完全被VP3甲基化的5′帽端的5′加帽或2′-O-病毒转录物，因此得出了RIG-Ⅰ是识别RV所必需，MDA-5只从旁协助的结论，不过有研究表明MDA-5不仅是RV感染所必要的识别受体，而且它可以通过MAVS产生NF-κB诱导炎性反应与细胞凋亡[18]。这些结果看似相悖，但是解释了RIG-Ⅰ与MDA-5可能不仅仅根据RV-dsRNA片段的长短还可能根据其转录物RV-ssRNA的刺激潜能来决定协同还是独立去激活IFN反应，并且在病毒感染的前期和后期RV的转录水平不同、VP3编码的鸟苷酸转移酶和甲基转移酶是否可以完全甲基化转录物以及其在胞内集聚差异导致RLR的选择性识别。因此，更加准确的定义RIG-Ⅰ/MDA-5的激活信号是未来研究抗RV先天免疫的先决条件。

2.4 NLR介导的抗RV免疫应答

先天免疫细胞可以通过激活一种定位在胞浆中的核苷酸结合寡聚化结构域受体NLRs，识别细菌和病毒病原体模式激活特殊的蛋白复合物(炎性小体)，分泌特定的炎性因子，引发细胞凋亡与细胞焦亡。NLRP3识别包括病毒RNA在内的多种刺激，RRV感染NLRP3基因缺失小鼠可激活炎症反应，诱发上皮损伤，说明NLRs同样是抗RV感染重要途径[19]。研究表明，IECs中也存在NLR。RNA解旋酶DHX9结合RV-dsRNA片段后被IECs上特异性高表达的NLRp9b识别，募集凋亡相关斑点样蛋白ASC，此时pro-caspase-1裂解活化形成caspase-1并与NLRP9b-ASC形成炎性小体，一方面caspase-1催化由TLR介导所产生的原料pro-IL-18以及pro-IL-1β成熟，产生炎性因子IL-18、IL-1β；另一方面激活死亡募集域gasdermin D 启动细胞焦亡，清除病毒感染[20]。

3 其他先天免疫途径预防RV感染的策略

许多学者通过探索其他先天免疫途径试图寻找限制RV新策略。研究表明，单独使用Ⅰ型IFN不能限制IFNLR缺失小鼠RV的复制，Ⅰ/Ⅲ型IFN必须协同作用才能有效限制RV[21]。Saxena K等通过研究HRV感染HIEs(人肠道类器官)发现，尽管RV感染诱导的Ⅲ型IFN应答最为强烈，但是外源添加的Ⅰ型IFN抗RV效果最好[22]。Holloway G等研究表明RRV感染可激活IECs JNK/P38通路诱导AP-1磷酸化导致细胞凋亡和增强病毒复制，说明JNK/P38对于RV的复制起到一定促进作用[23]。Ding等通过CRISPR-Cas9筛选方案发现了RV感染的新先天免疫调节因子，黏着蛋白复合物一个重要组成成分STAG2的缺失可诱发宿主基因组损伤并激活cGAS-STING-IRF3信号通路产生IFN，抵抗RV感染[24]。肠道共生菌是维持肠道稳态的关键因素，也是近些年的研究热点。Zhang B等发现细菌鞭毛蛋白被DCs中的TLR5识别，与MyD88结合产生IL-12和IL23,从而激活ILC3释放IL-22，治疗和预防慢性RV感染[25]。证实了微生物群、肠道先天免疫系统与RV三者有着复杂的相互作用。

综上所述，论文阐述了RV感染IECs诱导宿主先天免疫应答几种途径，然而病毒与宿主通过不断抗争实现共同进化，只有深入了解RV和肠道先天免疫系统才能实现人类健康与无害养殖的最终目标。因此，探究RV编码蛋白通过何种方式逃逸免疫以及解释宿主先天免疫系统通过何种机制阻断RV感染是将来研发抗RV药物和疫苗的重要基础。