甲型流感病毒NS1蛋白研究进展

任晨洋，马巍威，张 莹

(沈阳农业大学 畜牧兽医学院/东北畜禽疫病研究教育部重点实验室，辽宁沈阳 110161)

甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，为8节段的单股负链RNA病毒，是人类呼吸道感染的主要病因之一，可以导致每年的季节性流感和偶尔的流感大流行。IAV基因组编码的非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1)是影响病毒致病性的关键毒力因子，为宿主免疫反应的强效拮抗剂，在IAV感染过程中发挥重要的作用。

NS1是由IAV第8个RNA节段编码的高度保守的多功能蛋白，分子质量约为26 ku，含有215～237个氨基酸。其分为4个不同的区域：位于N端的RNA结合区(RNA-binding domain,RBD)、连接区以及位于C端的效应结构域(effector domain,ED)和C端尾巴。RBD和ED两个功能性结构域通过与大量宿主蛋白相互作用来促进NS1的免疫抑制作用。NS1主要以开放构象存在于溶液中，表现出不依赖于毒株的结构可塑性，使其能够在病毒感染期间与多种细胞因子配体相互作用[1]，在拮抗宿主干扰素(interferon,IFN)、抑制细胞凋亡、抑制宿主mRNA的加工和核输出、促进病毒mRNA的翻译等方面发挥作用。本文将对IAV NS1蛋白的功能作系统介绍。

1 NS1促进IAV复制

IAV M基因转录后的M1 mRNA经选择性剪接后可以编码多种蛋白，而NS1可以调控M1 mRNA的剪接，这一活性依赖于NS1的RNA结合能力，NS1还能通过与细胞NS1结合蛋白相互作用，使M1 mRNA向核散斑(nuclear speckles)转运，促进M1 mRNA剪接[2]。根据IAV基因组编码蛋白的表达动力学，其基因可以分为早期与晚期两类。由于RNA聚合酶Ⅱ抑制剂的存在，病毒晚期基因的mRNA核输出依赖于宿主细胞内的NXF1/TAP途径，NS1通过充当病毒mRNAs和NXF1之间的适配分子来促进病毒晚期基因mRNAs的核输出，这依赖于NS1的RBD结构域[3]。

NS1可以与病毒5’UTR、宿主的核多聚腺苷酸结合蛋白1(nuclear poly(A)binding protein,PABP1)和真核翻译起始因子4G(eukaryotic initiation factor 4G,eIF4G)结合，从而特异性地增强病毒mRNAs的翻译。NS1虽然可以直接与mRNA结合，但这与其刺激翻译的能力并不相关。增强病毒mRNA的翻译依赖于NS1与核糖体结合并招募它们靶向mRNA的特性，其中RBD中的R38和K41是关键氨基酸残基[4]。有研究表明当NS1与病毒dsRNA结合后，竞争性的抑制NS1与PABP1的结合，这表明dsRNA对NS1和PABP1相互作用的调节在病毒周期中可能是重要的[5]。

2 IAV NS1的免疫逃逸机制

2.1 NS1抑制IFN相关转录活化因子的产生

IAV侵入宿主呼吸道上皮细胞后，存在于感染细胞胞浆内的维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)识别IAV的RNA，发生构象变化，其caspase 募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)被释放出来，招募三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)等E3泛素连接酶，催化RIG-I发生K63泛素化修饰进而激活下游的线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)，传递抗病毒信号，激活核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)、干扰素调节因子(interferon regulatory factors,IRF)等转录活化因子并向核内转运，使I型IFNs大量表达[6]。

Rashmi等在RIG-I的启动子中发现了一个转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/Enhancer Binding Protein β,C/EBPβ)的结合位点，并表明NS1促进C/EBPβ磷酸化，并以C/EBPβ/NS1复合物的形式募集RIG-I启动子，从而抑制RIG-I的转录[7]。NS1 RBD与转录后的RIG-I pre-mRNA内含子序列相结合，改变pre-mRNA的加工过程，以抑制RIG-I的表达[8]。去泛素化酶OTUB1 水解K48多泛素链和与重组人泛素偶联酶UBCH5c形成E2抑制复合物是RIG-I发生K63泛素化的前提条件。NS1 ED可以引起OTUB1蛋白酶降解[9]，RBD则直接与RIG-I的CARD2和TRIM25的卷曲螺旋结构域相互作用，阻遏RIG-I的泛素化。有研究表明，NS1 R21残基在与CARD2的结合中发挥了重要作用，R21Q突变抑制了两者的结合能力，但不会影响NS1与TRIM25的结合[10]。NS1还能通过S42残基阻断IRF3的激活，以及诱导负调控IRF3的泛素编辑蛋白A20(也称TNFAIP3)大量表达来抑制Ⅰ型IFNs的产生。

2.2 NS1抑制宿主蛋白pre-mRNA的加工成熟

剪切和多聚腺苷酸化特异性因子4(cleavage and polyadenylation specific factor 4,CPSF4)是pre-mRNA加工成熟的必需蛋白酶，它在细胞核内裂解pre-mRNA并将Poly(A)尾巴添加到pre-mRNA的3’末端，增加mRNA的稳定性，使mRNA能进行核输出并翻译。NS1的F103和M106残基与CPSF4锌指结构域F2F3中的L72、Y88和P111等残基相互作用，使NS1与CPSF4结合，阻止pre-mRNA的加工成熟及核输出，使宿主蛋白的pre-mRNA在细胞核中大量堆积，抑制包括IFN在内的多种具有抗病毒作用的宿主蛋白表达。F103和M106还有助于转录后抑制抗病毒干扰素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)，但具体机制仍需进一步研究。Li等通过分析三株H5N1毒株发现NS1第55、66、133位残基影响其与CPSF4的结合。NS1/CPSF4复合体会调节宿主基因的选择性剪接，例如转录调节因子p53。NS1/CPSF4调节TP53转录本的选择性剪接，表达p53异构体，以此来拮抗p53介导的抗病毒反应[11]。RNA解旋酶UAP56在真核细胞中参与pre-mRNA的剪接和核输出。NS1 RBD 残基R38和K41可以与UAP56相结合，但不影响NS1介导的免疫逃逸机制，其确切作用有待确认[12]。

2.3 NS1抑制细胞凋亡

PI3K是由调节性p85β亚基和催化性p110亚基组成的异源二聚体酶。PI3K的激活可以抑制凋亡蛋白caspase-9与调控细胞代谢的糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的活化，进而抑制细胞凋亡。NS1 ED通过与p85β亚基的iSH2结构域结合，激活p110亚基，延缓细胞凋亡或改变PI3K的细胞分布为IAV复制带来有利条件[13]。1918年大流感的流感病毒NS1还劫持了另一种宿主蛋白CT10激酶调节因子(CT-10 regulator of kinase,CRK)，并通过ED的构象变化与P85β结合，形成三元复合物，导致PI3K的过度激活[14]。细胞坏死性凋亡是细胞凋亡受到抑制时出现的一种细胞程序性死亡的机制，IAV的NS1与磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL)的卷曲螺旋结构域2相互作用，增加了MLKL的寡聚和膜转位，破坏质膜和细胞内离子稳态，诱导细胞发生坏死性凋亡。同时，MLKL和NS1相互作用增强MLKL介导的NLRP3炎性小体激活，导致白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)分泌增加[15]。有关NS1引起细胞坏死性凋亡的具体机制目前尚不明确，还需进一步研究。

2.4 NS1其他免疫逃逸机制

锌指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein,ZAP)是一种具有抗病毒活性的宿主细胞限制因子，介导病毒mRNA的降解，NS1通过抑制ZAP与靶mRNA的结合拮抗其抗病毒活性[16,17]。RNA解旋酶MOV10通过与IAV NP相互作用，将病毒RNP隔离在细胞质中，NS1通过溶酶体途径降解MOV10[18]。NS1抑制c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)介导的自噬诱导和自噬小体对vRNP的隔离[19]。蛋白激酶R(protein kinase RNA activated,PKR)是一种可以抑制细胞蛋白质合成的蛋白激酶，在病毒感染细胞时激活。NS1的123-127位氨基酸和 N端高度保守的R35和R46可以结合并阻断PKR的激活[20]，保证病毒复制。

NS1能通过靶向NF-κB下调NLRP3炎性小体的激活，导致炎性细胞因子水平的降低。Hong-Su等发现2009年大流行的H1N1亚型流感病毒 NS1的C末端可以抑制ASC泛素化进而下调NLRP3介导的IL-1β的产生[21]。

RNA干扰是否构成哺乳动物体细胞抗病毒先天免疫反应的一部分仍然存在争议，NS1缺陷的IAV比野生型IAV在人类体细胞中产生了更高水平的siRNAs，但这些siRNAs实际上并不显著抑制IAV基因的表达。要证实NS1的RNA沉默抑制活性，还需要对哺乳动物系统进行更多的研究。

除了多种细胞内功能外，NS1还可以通过直接调节转录效应因子Ci/Gli的比活性来改变Hedgehog(HH)靶基因的表达，改变细胞间信号转导，影响IAV的复制[22]。

3 NS1与IAV进化

Chauché等通过鉴定马IAV的NS1，发现进化上不同的NS1通过不同的机制来抑制IFN反应，早期马IAV NS1通过与CPSF结合来阻止一般基因的表达，而较晚的NS1通过干扰JAK/STAT途径特异性地阻止IFN的产生，这与进化过程中先后出现的2个突变有关。说明病毒进化和免疫逃逸之间的相互作用在IAV哺乳动物适应中起着关键作用[23]。蝙蝠IAV NS1在拮抗IFN应答方面不如传统的IAV NS1有效，但这种不足通过PB2的特异性突变进行了弥补[24]。Antonio等通过结构导向的丙氨酸扫描了NS1 p85β结合域，研究不同IAV的结合谱，揭示了在人类中传播进化的IAV NS1功能的动态演变[25]。

阻断宿主基因表达的能力不是流感病毒在哺乳动物中复制所必需的，但在禽流感病毒对哺乳动物的长期适应中可能是重要的，犬流感H3N8 NS1能够有效地抑制IFN的反应，但不能阻止一般基因的表达，这可以通过将H3N8 NS1中的K186替换为H3N2 NS1中的E186来恢复，在犬H3N8和H3N2之间观察到的186位氨基酸多态性可能是禽源性IAV在哺乳动物体内获得适应性变化的结果[26]。2009年大流行的H1N1亚型流感病毒不能抑制一般宿主基因的表达，但目前流行的H1N1亚型流感病毒的NS1与原始蛋白相比发生了6个氨基酸变化，通过恢复与CPSF的结合的能力恢复了pH1N1 NS1抑制宿主基因表达的能力，这可能代表了H1N1亚型流感病毒对人类的适应[27]。

4 以NS1为靶点的IAV预防措施

NS1蛋白由于其结构、多重相互作用和在IAV复制和发病机制中的功能，是最有前途的新型抗流感药物靶点之一。Hiba等通过对NS1的晶体结构进行分析发现在RBD上存在一个能够满足可制药性标准的潜在结合袋状结构[28]。Alex等通过对A9(JJ3297)、A22进行结构分析，确定它们与NS1 ED 上的CPSF结合区域相互作用，这为两种针对NS1的抗流感化合物的作用机制提供了强有力的证据[29]。

在流感病毒进化过程中NS1 C端有时会自然发生截短突变，削弱抑制干扰素的作用，并诱导细胞凋亡，减弱病毒的复制和致病性[30]。Aitor等基于NS1的截短或完全缺失表现出减毒作用，并保持免疫原性的特点，制备了重组H3N8 犬流感疫苗[31]。Christina等评估了基于NS1基因缺失的H5N1减毒活疫苗在人类中的安全性和免疫原性，证明免疫后能诱导出显著水平的疫苗特异性抗体[32]。Aitor等验证了表达异型流感(B型、C型、D型)病毒NS1的重组IAV毒力减弱，支持了其用于开发安全有效的减毒活疫苗的可行性[33]。

Laura等发现人miRNA hsa-miR1307-3p是一种能有效抑制H1N1 IAV NS1表达和病毒复制的基因，有望用于抗病毒新疗法的开发[34]。

5 展望

根据世界卫生组织的数据，全世界每年约有10%的人口感染流感病毒，29万至65万人因此而死亡[1]。而IAV属于RNA病毒，变异速度快，使其预防成为难题。NS1作为流感病毒的主要毒力因子之一，参与了病毒侵袭宿主细胞的各个阶段，其通过与多种宿主因子和RNA相互作用，在拮抗抗病毒反应，促进病毒复制、传播、适应性进化等方面的发挥重要作用，因此深入研究NS1对于预防IAV具有重大意义。不同物种、不同毒株间的NS1存在功能性差异，这是流感病毒多样性特征的关键因素之一，有助于我们深入研究流感病毒的感染机制。例如传统的IAV NS1 p85β结合域在蝙蝠的IAV NS1中不能与PI3K的p85β亚基结合，无法有效激活PI3K通路，这说明在NS1上可能还存在一个未发现的负责PI3K激活的区域[35]。

IAV NS1上存在许多功能化位点，如乙酰化修饰位点K108、2个磷酸化位点Y73和S83、H5N1中保守的Y84残基，2009年H1N1亚型IAV中的Y171[8]等，这些氨基酸位点可以作为抗病毒药物研发的靶点。目前已获得了针对NS1的先导化合物，这是研究NS1导向的新型抗病毒药物的基础，而NS1截短型和缺失型重组病毒的毒力显著减弱也表现出NS1在流感疫苗研发上具有不俗的潜力。未来NS1抑制剂与NS1缺陷疫苗将会成为预防和控制流感病毒流行的有力武器。