艾灸及艾烟对载脂蛋白E基因敲除小鼠肺组织病理及血清IL-4、IFN-γ的影响*

刘津艺 和 蕊 赵百孝

（北京中医药大学，北京 102488）

动脉粥样硬化是指呈黄色粥样的脂质沉积在血管壁，形成斑块，导致动脉壁增厚变硬、管腔狭窄甚至闭塞，使重要器官缺血缺氧、功能障碍以至机体死亡，是心肌梗死、脑梗死、下肢缺血的主要病因［1］。经过数十年的探索和研究，因其在病变发生发展过程中始终有各种炎症细胞和大量炎症介质参与，目前现代医学已普遍认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。大量研究发现，艾灸疗法通过其温热效应在动脉粥样硬化过程中可抑制炎症反应，保护血管内皮功能［2-5］。尽管诸多研究已经证明了艾灸的有效性，但对于在艾灸过程中产生的艾烟的安全性仍存在一定争议。载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠是近年来动脉粥样硬化研究的经典动物模型，能够在自然膳食下形成严重的高脂血症，并自发形成纤维斑块和复合斑块，病理学改变与人类极为相似，因此广泛应用于动脉粥样硬化的研究中［6］。本实验通过观察艾灸及艾烟对ApoE-/-小鼠的一般情况和肺组织病理及血清白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）的影响，评价艾灸及艾烟的安全性，并探讨艾灸在动脉粥样硬化炎症反应过程中的起效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只8周龄采用高脂饲料喂养［北京科澳协力饲料有限公司，饲料配方为78.85%基础饲料+21%猪油+0.15%胆固醇，许可证号：京饲证（2018）06073］雄性ApoE-/-小鼠作为动脉粥样硬化模型，10只同周龄相同遗传背景的雄性非转基因小鼠C57BL/6作为空白对照。两种小鼠均购自维通利华（北京）生物技术有限公司，体质量（22±2）g，许可证号：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均饲养于北京中医药大学动物实验中心动物房单笼饲养，均可自由进食饮水，饲养环境温度为（22±2）℃，湿度为50%～60%左右。采用人工控制室内照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循环。

1.2 试剂仪器 小鼠IL-4酶联免疫试剂盒（Abbkine公司 KET7007 Lot：ATSJN0601）；小鼠IFN-γ酶联免疫试剂盒（Abbkine公司 KET7003 Lot：ATSJN0401）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）；PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；苏木素染色液（武汉谷歌生物科技有限公司）；伊红染色液（武汉谷歌生物科技有限公司）；特制细艾条（湖北蕲春李时珍医学集团，规格φ0.8 cm×15 cm）；小鼠固定器（北京冀诺泰有限公司）；光散射式数字粉尘测试仪（北京宾达绿创科技有限公司）；Thermo Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；石蜡切片机（LEICA RM 2235）；石蜡包埋机（LEICA EG 1160）；光学显微镜（Nikon E200）。

1.3 分组及处理 30只以高脂饲料喂养的雄性ApoE-/-小鼠［8周龄，体质量（22±2）g］随机分为模型组、艾灸组、艾烟组（每组10只）。10只以普通饲料喂养的雄性C57BL/6非转基因小鼠［8周龄，体质量（22±2）g］作为空白对照。空白组及模型组：采用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，每日抓取固定20 min，每周6 d，不予其他处理。

1.4 干预方法 艾灸组采用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位，固定器底板处的小孔可暴露胸腹部膻中穴，点燃艾条放置在小鼠胸部膻中穴下方2～3 cm处，每日施灸20 min，每周6 d。艾烟组釆用固定器固定小鼠头、尾、四肢部位后，将固定器放入内置有调试好的粉尘测试仪的玻璃缸中。在玻璃缸侧方圆孔中插入点燃的艾条，每隔3 min用粉尘测试仪测试其浓度，使玻璃缸中的艾烟浓度控制在5～15 mg/m3之间，每日艾烟干预20 min，每周6 d。

1.5 标本采集与检测 连续干预14周，末次干预后，禁食不禁水12 h。麻醉小鼠后，每组随机选取6只采用眼球摘除取血法采集血液约1～1.5 mL，离心后将血清保存于-20℃冰箱中备用。严格根据说明书标准程序操作，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中IL-4、IFN-γ的含量。剩余4只使用PBS缓冲液和4%多聚甲醛进行灌注后，取出肺脏置于4%多聚甲醛溶液中，用于制备石蜡切片，HE染色观察肺脏的病理改变。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。所用数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，对符合正态性分布且方差齐的计量数据，以（）表示，并采用单因素方差分析法；组间数据有显著性差异时，再用LSD法进行组间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况 实验干预14周后，未见小鼠死亡，存活率为100%。空白组小鼠外观体征、行为活动、精神状态等一般情况正常；模型组小鼠毛色晦暗且有脱落现象，体型肥胖，食欲逐渐下降，精神淡漠、反应迟钝。艾灸组小鼠毛色暗淡且有脱落现象，食欲、粪便未见异常，行为活动及精神状态尚可。艾烟组小鼠毛发有脱落现象且颜色暗淡，食欲、粪便未见异常，精神状态较安静。

2.2 各组小鼠体质量变化 见表1。实验开始前，各组小鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。实验第4周，模型组小鼠体质量显著高于空白组（P＜0.05），艾灸组和艾烟组小鼠体质量与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。第8周，空白组与模型组小鼠体质量增长均较快，但模型组体质量仍高于空白组（P＜0.05）。艾灸组和艾烟组小鼠体质量均低于模型组（P＜0.05）。第10周，模型组体质量高于空白组（P＜0.05），艾灸组和艾烟组体质量均低于模型组（P＜0.05）。第12周，模型组体质量仍大于空白组（P＜0.05），与模型组比较，艾灸组和艾烟组体质量较低（P＜0.05）。干预14周后，模型组体重有所降低，但仍高于空白组（P＜0.05），艾灸组与艾烟组体质量仍低于模型组（P＜0.05）。各组小鼠体质量为模型组＞空白组＞艾烟组＞艾灸组，有显著差异。

表1 各组小鼠体质量比较（g，±s）

表1 各组小鼠体质量比较（g，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别空白组模型组艾灸组艾烟组实验前23.30±0.37 23.44±0.57 23.53±0.32 23.49±0.45第4周26.09±1.00 27.64±0.74**25.80±1.23△△26.28±0.94△△第8周29.17±1.14 30.90±2.01*26.91±1.84△△28.43±1.28△△第10周30.93±2.01 32.70±1.15*28.82±1.83△△30.42±1.80△△第12周31.41±1.57 34.44±1.23**28.99±1.91△△31.95±1.70△△第14周32.00±1.29 33.64±1.70*29.55±2.05△△31.73±1.83△

2.2 各组小鼠肺组织的病理变化 空白组、模型组、艾灸组和艾烟组肺组织结构完整清晰，可见细支气管以及终末细支气管，立方形上皮细胞和扁平上皮细胞覆盖支气管管腔。Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞结构正常，扁平状的Ⅰ型肺泡细胞数量较多，立方形的Ⅱ型肺泡细胞数量较少。各组均可见肺泡管、肺泡囊和肺泡，部分细支气管可见不完整开口，为与肺泡连接处，肺泡为囊泡状，呈多面体，无结节状膨大。艾灸组和艾烟组未见明显异常。见图1。

图1 各组小鼠肺组织（HE染色，20倍）

2.3 各组小鼠血清IL-4含量比较 见表2。干预14周后，各组小鼠血清中IL-4含量从少到多依次为模型组＜艾灸组＜空白组＜艾烟组。模型组小鼠血清中IL-4含量最低，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；艾灸组和艾烟组小鼠血清中IL-4水平与模型组相比，含量均显著升高（P＜0.01）。

表2 各组小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比较（pg/mL，±s）

表2 各组小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比较（pg/mL，±s）

组别空白组模型组艾灸组艾烟组n 6 6 6 6 IL-4 7.67±0.16 4.59±0.27**6.04±0.27△△8.26±0.75△△IFN-γ 6.95±0.93 13.14±1.32**4.53±0.76△△9.79±1.02△△

2.4 各组小鼠血清IFN-γ含量比较 见表2。干预14周后，各组小鼠血清中IFN-γ的含量从多到少的顺序依次为模型组＞艾烟组＞空白组＞艾灸组。模型组小鼠血清中IFN-γ含量最高，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；艾灸组和艾烟组小鼠血清中IFN-γ水平与模型组相比，含量均显著降低（P＜0.01）。

3 讨论

中医理论认为，动脉粥样硬化与“痰湿、气滞、瘀浊”密切相关，在各种致病因素的综合影响下，导致痰瘀互结、脉道不利、瘀血内阻，脏腑气机失调，使得病理产物在脉道内不断堆积，最终导致动脉粥样硬化斑块的形成。艾灸作为传统中医中十分重要的一部分，具有温阳散寒、活血通脉的作用。《景岳全书》云“凡大结大滞者最不易散，必欲散之，非藉火力不能速也，所以极宜用灸”，说明艾灸通过其温热效应可以温通经脉、行气活血，进而祛除痰湿瘀浊等病理因素，促进病理产物的排出，减缓动脉粥样硬化的病理演变。但长期以来，艾烟的安全性仍存在争议，也因此限制了传统艾灸的推广和发展。实验以ApoE-/-小鼠为动物模型，以同周龄相同遗传背景的非转基因小鼠C57BL/6作为空白对照，通过观察各组小鼠的一般情况以及肺组织的病理变化来评价艾灸及艾烟的安全性。小鼠的一般情况主要指生存率、体质量以及行为状态描述，可直接反映艾灸及艾烟的安全性。通过实验结果可知，各组小鼠在干预前均无异常，一般情况无差异，但ApoE-/-小鼠在实验14周后，出现毛色晦暗且有脱落现象，体型肥胖，精神淡漠、食欲下降，反应迟钝等情况。中医学认为，动脉粥样硬化的主要病机在于痰浊壅盛、气血瘀阻。痰浊壅盛则多见毛发脱落、体型肥胖、精神淡漠，反应迟钝。气血瘀阻则见毛色晦暗、食欲下降运化失司等表现。实验过程中未出现小鼠死亡情况，生存率为100%，说明实验操作对小鼠的应激作用较小，不影响小鼠的正常生存。实验前各组小鼠体质量无差异，在前8周各组小鼠体质量均呈现显著增长趋势，实验第8～14周体质量增长趋势较缓。模型组ApoE-/-小鼠体质量明显大于空白组C57BL/6小鼠，这一现象与小鼠的基因型和喂养饲料不同有密切关系。ApoE-/-小鼠由于被敲除载脂蛋白E基因，随自身生长逐渐出现脂代谢紊乱异常，进而导致脂质积聚，加以采用高脂高胆固醇饲料喂养，加速了动脉粥样硬化的进程，引起模型组小鼠体质量增量与空白组C57BL/6小鼠相比显著增加。艾灸组小鼠体质量平均值低于空白组，艾烟组小鼠体质量在某些实验时间节点也低于空白组，这可能是艾灸和艾烟改善脂质积聚，减缓动脉粥样硬化进程的良性结果。

肺组织HE染色病理切片显示艾灸及艾烟对肺组织无明显影响。黄剑等［7］通过不同浓度艾烟干预12周对大鼠肺和骨骼肌的结果显示，亚急性毒理实验低、中、高浓度艾烟（艾烟浓度分别为2.5～3.5、8.0～10.0、27.0～29.0 mg/m3）对大鼠肺组织未见明显损伤，与本实验结果一致。其中高浓度艾烟组浓度为27.0～29.0 mg/m3，远远高于艾灸诊室的艾烟浓度3.54 mg/m3［8-9］。本实验艾烟组浓度为5～15 mg/m3，艾烟的浓度远低于可吸入颗粒物的风险浓度。因此艾灸及艾烟对小鼠肺组织无影响，证明艾灸及艾烟具有一定的安全性。

在整个动脉粥样硬化的进程中，炎症反应贯穿始末。在这一炎性进展中，首先产生的是内皮功能损伤以及功能障碍，进而激发一系列的炎症反应，产生大量的炎性因子浸润血管壁，参与动脉粥样硬化斑块的发生及发展［10］。这些炎性因子又分为促炎性因子和抑炎性因子，在动脉粥样硬化的形成和发展过程中起着十分重要的作用。IL-4主要由Th2细胞产生，是典型的抑炎性因子，其抑制炎症反应的主要机制是通过抑制单核-巨噬细胞以及IFN-γ、白细胞介素-1（IL-1）等Th1细胞因子，进而抑制动脉粥样硬化进程中的炎症反应［11-13］。因此IL-4被认为是一种抗炎细胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干扰素，主要由平滑肌细胞、巨噬细胞和Th1细胞分泌，又被称为“巨噬细胞活化因子”，具有激活巨噬细胞、血管内皮细胞、NK细胞并促进其功能的作用［14-15］。与此同时可产生炎性细胞因子、氧自由基和金属蛋白酶，进而激发炎症反应。大量的研究表明，IFN-γ在动脉粥样硬化中高水平表达［16］。IFN-γ的促炎作用主要是通过旁分泌和自分泌途径引起局部炎症反应，从而减少平滑肌细胞的浸入和再生、大量的减少胶原合成、增加细胞外基质降解蛋白的过度表达，进而导致动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄并且抑制纤维帽的形成，最终加速了易损性斑块的形成进程［17］。有研究者发现，被试小鼠施行基因敲除术造模成缺乏内源性IFN-γ的小鼠病变斑块中巨噬细胞含量减少，斑块纤维化程度升高，因此其动脉粥样硬化病症的进展速度和普通小鼠相比有所减缓，病变程度明显减轻［18-19］。本实验运用艾灸及艾烟作为干预手段，观察艾灸及艾烟在动脉粥样硬化过程中的抗炎作用。结果显示模型组IL-4水平降低、IFN-γ水平上升，反映出模型组小鼠动脉粥样硬化过程中的炎性反应，艾灸及艾烟组IL-4较模型组水平上升、IFN-γ水平下降，说明艾灸可抑制促炎性因子IFN-γ的产生、促进抑炎因子IL-4的释放，能明显降低动脉粥样硬化过程中的炎性反应，起到了抗炎作用。综上，艾灸及艾烟具有一定的安全性，在防治动脉粥样硬化的过程中有确切的作用，其机制可能与降低动脉粥样硬化中的炎性反应有关。