体外产气法评价榆树叶在反刍动物日粮的应用

袁 玖，柳 振，代春辉，王春卉，杨 帆，陈国顺，万欣杰

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.兰州联邦饲料有限公司，兰州 730060）

榆树（Ulmus pumilaL.），又名春榆、白榆、家榆、榆钱等，分布于中国东北、华北、西北及西南各省区。榆树叶（Elm leaves，E）资源丰富，取材方便。新鲜榆树叶含粗蛋白质7.5%，无氮浸出物14%，富含矿物质和胡萝卜素。一般于7～9月采收榆树叶，摘取其2/3部分，避免折断树枝[1]。榆树叶青喂、打浆喂或风干处理后，添加干精饲料（地瓜面、玉米面、高粱面）饲喂生猪，可防病促生长，但单独饲喂无法完全满足动物营养需要。通过与苜蓿（Medicago sativa）等饲料搭配使用，可发挥饲料间正的组合效应（Associative effects，AE），改变动物胃肠道代谢过程[2-3]。谷草∶苜蓿按50∶50 配比时，AE 最优[4]。玉米秸秆∶苜蓿按50∶50、60∶40、燕麦干草∶玉米秸∶苜蓿按10∶50∶40、20∶50∶30 配比时，体外发酵参数和AE 最高[5]。研究表明，苜蓿与低质粗饲料搭配可改善饲料利用率，发挥饲料间AE 正向作用[6]。精料与秸秆类、禾本科牧草配比后综合AE 指数（Multiple-factor AE index，MFAEI）均 >1， 为 1.273～1.620， 而 精 料 与 苜 蓿MFAEI 为0.819[7]。精料∶羊草∶玉米秸青贮∶燕麦草为 50∶15∶10∶25 时，MFAEI 最佳[8]。目前，榆树叶未得到充分利用，尚未见其应用于反刍动物饲粮。本研究旨在利用体外产气法测定不同精粗比下榆树叶与苜蓿、精料搭配组合后单项和组合效应，获得正AE较优组合，为养殖生产中榆树叶应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

精料、苜蓿购于兰州联邦饲料有限公司，榆树叶采集于兰州市植物园。精料配方组成（风干基础）∶玉米（Zea maysL.）85.00%，豆粕7.75%，棉粕3.10%，食盐1.65%，复合预混料2.50%。

试验用产气管为德国制造100 mL 玻璃注射器（最小刻度1 mL）。

1.2 试验设计

试验以精粗比设为 60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80。精料∶榆树叶∶苜蓿20 个配比，精料∶榆树叶5 个配比，3 种原料单独培养，共计28种饲粮组合，每组7 个重复，共培养196 个产气管。试验分3批，每批设3个空白对照，消除体外培养系统误差。具体饲粮配比见表1。

表1 28种饲粮组合比例Table 1 Proportion of 28 kinds of diets combination

1.3 瘤胃液供体动物及饲养

试验用瘤胃液采自年龄约4.5 岁、体重（500±2.9）kg安装永久瘤胃瘘管的6头荷斯坦奶牛，自由采食麦秸，精料5 kg·d-1·头-1，日喂3 次，自由饮水。精料组成和营养水平见表2[9]。早饲前采集6头牛瘤胃液，混合后4 层纱布过滤至暖瓶，通入CO2保持厌氧，待用。

1.4 体外发酵培养程序

榆树叶、精料、苜蓿3 种原料，干燥、粉碎、过1 mm 标准筛。准确称取28 种饲粮组合0.2000 g（DM 基础），置于3 cm×5 cm 400 目尼龙袋，扎紧，置产气管，将39 ℃微生物培养液30 mL（10 mL 瘤胃液+20 mL缓冲液，缓冲液配制参照Menke等[10]方法）加入产气管，推出管内空气，密封乳胶管一端，读数，记录产气管初始刻度（mL，GP0）后，置于39 ℃恒温水浴锅，在培养2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 时，分别记录各时间点产气量（Gas production，GP，mL）。某饲粮组合在某时间点GP=该段时间样品管GP-样品管0 h时初始读数（GP0h）-该段时间空白管GP空白。

表2 瘘管荷斯坦奶牛日粮中精料的配方组成和营养水平（%，DM基础）Table 2 Ingredients and nutritional levels of the concentrate of the experimental diet for Holstein-Friesian cows(%,DM basis)

1.5 上清液及残渣采集

72 h培养结束后，用蒸馏水洗净尼龙袋，105 ℃烘48 h 至恒重，测定干物质降解率（Dry matter digestibility,DMD）。残渣测定粗灰分，计算有机物降解率（Organic matter digestibility，OMD）。培养液5 000×g 离心10 min，上清液移至离心管，-20 ℃保存，待测挥发性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA）和氨态氮（NH3-N）。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 饲料常规营养水平

榆树叶、苜蓿、精料干物质（Dry matter，DM）、粗蛋白质（Crude protein，CP）、粗脂肪（Ether ex⁃tract，EE）、粗纤维（Crude fiber，CF）和粗灰分（Crude ash）含量采用美国分析化学家协会（Associ⁃ation of Official Analytical Chemists，AOAC）[11]概略养分法测定。

1.6.2 产气指标计算

①GP测定。GPt=200×(Vt-V0)/W

式中，t为发酵开始后某一时间（h）；GPt为样品t时刻产气量（mL）；Vt为样品发酵t小时后产气管读数；Vo为开始培养时空白管读数；W为样品干物质重量（mg）。

②产气参数计算。利用“fit curve”软件，Фrskov等产气模型公式GP=a+b（1-e-ct）[12]，将2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 时GP 代入，计算a、b、c等消化动力参数。式中，t为发酵开始后某一时间（h）；a为快速产气量（mL）；b为缓慢产气量（mL）；c为b产气速度常数（%·h-1）；（a+b）为潜在产气量（mL）。

1.6.3 瘤胃发酵参数、DMD、OMD测定

采用梅特勒-托利多FE20 型酸度计测定pH；采用Lu等[13]气相色谱法测定VFA浓度。采用Brod⁃erick 和Kang[14]方法测定NH3-N 浓度；干物质降解率（DMD，%）=（原样品重量×原DM含量-残渣样品重量×残渣 DM 含量）/原样品重量×原 DM 含量×100%；有机物降解率（OMD，%）=（原样品重量×原OM含量-残渣样品重量×残渣有机物含量）/原样品重量×原有机物含量×100%。

1.6.4 组合效应计算

单项组合效应指数（Single-factor associative ef⁃fects index，SFAEI）和综合组合效应指数（Multiplefactor associative effects index，MFAEI）参照方法[15]。

SFAEI=（各组合实测值-加权估算值）×100/加权估算值

式中，实测值为各组合实际测定值，加权估算值=精料实测值×精料配比（%）+榆树叶实测值×榆树叶配比（%）+苜蓿实测值×苜蓿配比（%）。

1.7 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS 16.0 软件作单因子方差分析，结果以平均值和平均标准误（Standard error of Mean，SEM）表示，以P<0.05 表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。差异显著时，用Tukey氏法作多重比较。

2 结果与分析

2.1 单一饲料营养水平及体外产气参数

由表3 可知，榆树叶（11.2%）CP 小于精料（19.5%）和苜蓿（19.9%）；在EE 和CF 上，榆树叶均小于苜蓿，大于精料。精料和苜蓿快速产气部分a（-9.8 mL、-3.7 mL）为负值，存在产气滞后效应；榆树叶a 值为5.7 mL，产气不滞后。榆树叶（52.8 mL、50.3 mL）潜在产气量（a+b）、72 h 产气量 GP72h均高于精料（45.0 mL、42.5 mL）和苜蓿（27.2 mL、26.1 mL）。

表3 饲料营养水平及体外产气参数（绝干基础）Table 3 Nutritional levels and in vitro gas parameters of experimental diets(Dry matter basis)

2.2 各饲粮组合产气参数及发酵指标

由表4～5 可知，不添加苜蓿时，精料∶榆树叶（C∶E）为80∶20、60∶40 组a、b、c、DMD、OMD、乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸（Total volatile fatty acids，TVFA）均显著高于其他组（P<0.05），NH3-N、GP72h、（a + b）均极显著高于其他组（P<0.01），50∶50组丁酸显著高于40∶60、20∶80组（P<0.05），50∶50组乙酸、TVFA、GP72h、a、（a+b）与其他组无显著差异（P>0.05）。20∶80、40∶60和50∶50 组pH 显著高于80∶20、60∶40（P<0.05）。C∶R 为60∶40时，精料60%，榆树叶和苜蓿共40%。榆树叶∶苜蓿（E∶A）为10∶30 组（榆树叶配比为10%，简称“10 组”，下同）a、戊酸显著高于 30 组（P<0.05），10组c、乙酸、丙酸、异戊酸和TVFA显著高于 20、30 组（P<0.05），10 组（a+b）、DMD、OMD 极显著高于其他组（P<0.01），10 组GP72h极显著高于 30∶10 组（P<0.01），10、20 榆树叶组 b、NH3-N均显著高于30组（P<0.05），10组pH显著低于其他组（P<0.05）。

C∶R为50∶50时，精料50%，榆树叶和苜蓿共50%。E∶A 为 20∶30 组（简称“20 组”）a、NH3-N 显著高于30、40 组（P<0.05），20 组 b 显著高于 40 组（P<0.05）；20、10 组c、戊酸、异戊酸显著高于30、40 组（P<0.05）；20 组（a+b）、GP72h极显著高于其他组（P<0.01），且30、10 组极显著高于40 组（P<0.01）；20、10 组DMD、OMD 极显著高于其他组（P<0.01）；20、10 组 pH 显著低于其他组（P<0.05）；20组乙酸、丙酸、TVFA显著高于其他3组（P<0.05）。

C∶R为40∶60时，精料40%，榆树叶和苜蓿共60%。40 榆树叶组a、c、（a + b）极显著高于50、30、10 组（P<0.01）；40 组 GP72h、NH3-N、乙酸、丙酸显著高于50、30、10 组（P<0.05）；40、30 组b、DMD 极显著高于其他3 组（P<0.01）；40、30 组OMD、丁酸、异戊酸、戊酸显著高于其他组（P<0.05）；40 组TVFA 显著高于其他组（P<0.05），且30 组显著高于50、20、10 组（P<0.05）；40、30 组pH 显著低于其他 3 组（P<0.05）。C∶R 为30∶70 时，精料30%，榆树叶和苜蓿共70%。55、40 榆树叶组a、c、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸、TVFA均显著高于25、10 组（P<0.05）；55、40 组b、（a+b）、GP72h、DMD、OMD、NH3-N 均极显著高于25、10 组（P<0.01）。C∶R 为20∶80 时，精料20%，榆树叶和苜蓿共80%。20 榆树叶组a、c、乙酸、丙酸、TVFA 显著高于 65、50 组（P<0.05）；20 组DMD、OMD 极显著高于65、50 组（P<0.01）；20 组丁酸、异戊酸显著高于其他组（P<0.05）；20 组b、（a+b）、GP72h、NH3-N 极显著高于其他组（P<0.01），且50 组（a+b）、GP72h极显著高于65、50组（P<0.01）；20组pH显著低于其他组（P<0.05）。

表4 榆树叶与苜蓿、精料混合体外培养72 h后产气及发酵参数Table 4 GP and fermentation parameters at 72 h when elm leaves was incubated with alfalfa,concentrate in vitro

表5 榆树叶与苜蓿、精料混合体外培养72 h后挥发性脂肪酸含量Table 5 Volatile fatty acids at 72 h when elm leaf was incubated with alfalfa and concentrate in vitro (mmol·L-1)

2.3 各饲粮组合单项组合效应值和综合组合效应值

由表6可知，不添加苜蓿时，精料∶榆树叶（C∶E）为 80∶20、60∶40 组 5 个 SFAEI（GP72h、DMD、OMD、TVFA、NH3-N 的AE）和MFAEI 极显著或显著高于其他3 组（P<0.01，P<0.05）。C∶R 为60∶40时，榆树叶：苜蓿（E∶A）为10∶30、20∶20 组GP72h和TVFA的AE极显著高于30∶10组（P<0.01）。10∶30组 DMD 的 AE 极显著高于 20：20、30：10 组（P<0.01），10∶30 组 OMD 和 NH3-N 的 AE 极显著高于30∶10 组（P<0.01）。在MFAEI 上，10∶30 组极显著高于20∶20、30∶10组（P<0.01），20∶20组极显著高于30∶10组（P<0.01）。

表6 榆树叶与苜蓿、精料混合体外培养72 h后SFAEI和MFAEITable 6 SFAEI and MFAEI after fermentation for 72 h when elm leaves was incubated with alfalfa and concentrate in vitro

由表6 可知，C∶R 为50∶50 时，E∶A 为20∶30、10∶40组GP72h、OMD的AE极显著高于30∶20、40∶10 组（P<0.01）；20∶30 组 DMD 的 AE 极显著高于其他组（P<0.01）；20∶30 组NH3-N 的AE 显著高于其他组（P<0.05），10∶40组显著高于30∶20、40∶10组（P<0.05）；在 TVFA 的 AE 和 MFAEI 上，20∶30 组极显著高于其他组（P<0.01），10∶40组极显著高于30∶20、40∶10 组（P<0.01）。C∶R 为 40∶60 时，E∶A为 40∶20 组的 GP72h、DMD 的 AE 极显著高于 50∶10、20∶40、10∶50 组（P<0.01）；在OMD、TVFA、NH3-N 的 AE 和 MFAEI 上，40∶20 组极显著高于其他组（P<0.01），30∶30 组极显著高于50∶10、20∶40、10∶50 组（P<0.01）。C∶R 为 30∶70 时，E∶A 为55∶15、 40∶30 组 GP72h、 DMD、 OMD、 NH3-N、TVFA 的 AE 和 MFAEI 极显著高于 25∶45、10∶60 组（P<0.01），且25∶45组NH3-N、TVFA的AE极显著高于 10∶60 组（P<0.01）。C∶R 为 20∶80 时，E∶A 为20∶60 组 GP72h的 AE 极显著高于 65∶15、50∶30 组（P<0.01）；20∶60、35∶45组OMD的AE极显著高于65∶15、50∶30 组（P<0.01）；20∶60 组 DMD、NH3-N、TVFA 的 AE、MFAEI 极显著高于其他组（P<0.01），35∶45 组 NH3-N 的 AE 极显著高于 65∶15 组（P<0.01），35∶45 组DMD、TVFA 的AE、MFAEI极显著高于65∶15、50∶30组（P<0.01）。

3 讨 论

榆树叶a为正值，即产气不滞后。精料、苜蓿a为负值，精料比苜蓿产气滞后时间更长。因为本研究中，玉米占85%，较大麦（Hordeum vulgareL.）有更长产气滞后时间[16]。精料b 和c 较高，榆树叶GP72h和（a+b）最高，表明3种饲料中，榆树叶产气性能最佳。

本试验中，饲粮AE 效果较优的6 个组合依次为：30∶55∶15>40∶40∶20>50∶20∶30>20∶20∶60>60∶10∶30>80∶20∶0，即 C∶R 依 次 为 30∶70、 40∶60、50∶50、20∶80、60∶40及无苜蓿组。低精料配比高粗料（C∶R 为30∶70）时，高比例榆树叶（55、40）及低比例苜蓿（15、30）组合效果最佳；随精料增加（C∶R为40∶60、50∶50、60∶40），AE效果降低，需配比榆树叶比例亦降低（40、20、10），即精料越高，越不利于榆树叶利用。精粗比为30∶70时，不同饲料间协同互作效果最强，饲料间AE最大。说明在一定程度上榆树叶可替代精料使用量。由此可知，不加苜蓿组AE最小，苜蓿、榆树叶、精料3 者配比组合后AE 效果显著优于榆树叶、精料组合。树叶与精料配比，GP的AE为正[17]。苜蓿配比小麦秸（Triticum aestivumL.），产气参数呈正AE[18]。将慢速发酵纤维（纯纤维素、奶蓟草）速发酵纤维（无籽番茄（Solanum lycopersicum）、柑橘渣、果胶）按 75∶25 或 25∶75 配比后，GP 显著增加[19]。前人及本试验结果均表明，低质粗饲料与优质牧草及精料科学搭配后，可产生正AE。

GP 可有效预测饲料在瘤胃中消化率[20]。将单一及配比饲料体外培养，通过GP 等指标可确定混合饲料AE。皇竹草∶象草为75∶25 时，山羊瘤胃DM、CP 及 NDF 降解率及其正 AE 最高[21]。郝小燕等、成启明等研究表明，苜蓿∶青贮玉米∶玉米纤维饲料为40∶39∶21，而玉米秸∶柠条为70∶30 时，AE效果最佳[22-23]。瘤胃pH为6.0～7.0，可充分反应瘤胃内发酵情况和环境变化。本研究中，60∶10∶30、 50∶20∶30、 50∶10∶40、 40∶40∶20、 40∶30∶30、30∶55∶15、30∶40∶30、20∶20∶60、80∶20∶0、60∶40∶0 组pH 显著低于同精粗比的其他组。因为这10个组合产气和发酵参数较高，TVFA较高。VFA速度快于瘤胃对其的吸收速度，降低瘤胃内pH。

GP 与瘤胃微生物发酵活性、饲料消化率呈正相关[10]。DMD 和OMD 是衡量饲料营养价值的重要指标。本研究中，GP、DMD 和OMD 变化趋势一致。苜蓿有效降解率较高，碳氮比更适合瘤胃微生物繁殖[24]。苜蓿配比低质牧草后GP、DM 采食量、NDF 消化率呈正AE[25]。NH3-N 浓度可充分反映饲料在瘤胃中蛋白质分解、氮代谢、微生物蛋白质合成情况。本研究中，25 种饲粮组合NH3-N浓度为 10.27～23.41 mg·dL-1，处于正常范围。30∶55∶15、40∶40∶20、50∶20∶30、20∶20∶60、60∶10∶30、80∶20∶0组NH3-N显著高于其他组，原因是这6 个组合中精料、榆树叶、苜蓿之间发生协同作用，增强瘤胃内碳、氮同步释放，促进微生物蛋白质合成效率。饲粮中可消化碳水化合物发酵产生VFA，GP 与TVFA 产量呈正相关，与乙酸亦呈正相关。乙酸/丙酸反映瘤胃发酵类型。本研究中，25 种饲粮组合乙酸/丙酸均大于3，属于乙酸发酵型，有助于反刍动物乳脂率提高。

单项组合效应指数（SFAEI）仅通过某一指标评价饲粮AE，缺乏代表性和准确性。卢德勋根据体外产气法在不同时间点测定各项指标，提出“综合组合效应指数（MFAEI）”概念[26]。韩肖敏等、李妍等研究发现稻草∶玉米秸∶玉米秸青贮∶精料为6.4∶9.6∶24∶60，谷草∶玉米秸为40∶60，谷草∶玉米秸∶玉米秸青贮为8∶12∶80时，MFAEI较佳[27-28]。不同种类粗饲料或精、粗饲料配比组合后，由于营养素互补，日粮整体发酵水平和发酵性能更高。本研究发现，精料∶榆树叶∶苜蓿最佳MFAEI 组依次 为 30∶55∶15、 40∶40∶20、 50∶20∶30、 20∶20∶60、60∶10∶30、80∶20∶0 组；尤以精粗比30∶70 时MFAEI 最佳，30∶55∶15 组为 501.87%，30∶40∶30组为441.81%，40∶40∶20 组为439.00%。推测原因可能为原料中鞣酸、发酵基质间相互作用，改善底物降解特性，提高饲料消化率。