响应面法优化玉米醇溶蛋白提取工艺及抗氧化活性评价

王 岩，王建宇，于 璐，袁凤娟，张 萌，吴红艳，高建伟，王拓一

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

玉米籽粒中主要储存蛋白为醇溶蛋白，占玉米胚乳蛋白质总量35%～60%[1-2]。玉米醇溶蛋白是由大量非极性氨基酸组成的带正电荷疏水性蛋白质，易溶于乙醇水溶液，是玉米深加工最重要的工业副产物之一[3]。玉米醇溶蛋白主要存在于玉米湿法加工制备淀粉过程剩余物玉米蛋白粉（玉米黄粉）中[4-5]。虽然玉米醇溶蛋白缺乏以赖氨酸和色氨酸为代表的必需氨基酸，营养价值降低，且不溶于水，但因其特殊的氨基酸组成和物化性质，可塑性、涂膜性、可降解性和抗氧化性较好等，可用于果蔬保鲜、食品包装、可降解材料制备等生产活动[5-6]。在特种食品、制药和生物可降解塑料工业中应用前景广泛[7-8]。

目前，玉米醇溶蛋白提取主要方法包括异丙醇提取法[9]、乙醇提取法[10-11]、超声波辅助提取法[12]和微波提取法[13]等。在提取过程中，提取条件对玉米醇溶蛋白结构产生一定影响，最终影响其应用性质，如抗氧化性[14-15]。因此，从成本和应用两方面，优化提取条件，更有利于醇溶蛋白加工利用。

Cook 等对比不同有机溶剂对玉米醇溶蛋白影响，结果表明提取从高到低依次为乙酸、60%异丙醇、90%乙醇和80%乙醇，说明不同有机溶剂和浓度影响提取率，并指出采用两种溶剂系统提取更便于玉米醇溶蛋白回收[16]。张媛媛研究结果表明，利用微波辅助提取工艺，极大缩短提取时间，降低生产成本，但因于过程中内部温度骤升，改变蛋白质结构，影响加工性能[13]。Gu 等采用超声波辅助提取玉米醇溶蛋白，提高提取效率，降低提取温度，同样对蛋白质微观结构造成一定程度影响，提取的玉米醇溶蛋白纯度高[17]。任晓峰等研究表明，超声波辅助处理增加玉米醇溶蛋白水溶性，显著提高提取效率[18]。目前工业上大规模制备玉米醇溶蛋白主要以乙醇为提取溶剂，通过物理和生物技术等手段辅助提高提取效率，一定程度上改变玉米醇溶蛋白结构和功能。

本文以玉米蛋白粉为原料，选取超声波辅助提取，选择提取温度、提取时间、乙醇浓度、pH和固液比5个因素作单因素试验，再通过响应面试验设计法优化提取过程参数，确定最佳提取工艺，评价已提取醇溶蛋白抗氧化活性，以期为醇溶蛋白提取、加工和利用提供基础试验数据，为工业化生产工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米黄粉（购自齐齐哈尔阜丰生物科技有限公司），无水乙醇、氢氧化纳、盐酸、DPPH、ABTS+·、硫酸亚铁、水杨酸、过硫酸钾和抗坏血酸等均为分析纯（购自阿拉丁试剂上海有限公司）。

1.2 仪器设备

SK3300HP 超声波清洗机（购自上海科导超导仪器有限公司），SH2-D 循环水式真空泵（购自巩义市英峪予华仪器厂），DF-Ⅱ集热式磁力搅拌器（购自江苏省金环市医疗仪器厂），DHG-9145A 电热恒温古风干燥箱（购自上海一恒科技有限公司），步琦K370 全自动凯式定氮仪（购自瑞士步琦有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白提取工艺流程

玉米蛋白粉→过筛（80 目）→加入乙醇→调pH、温度→超声波辅助提取（功率180 W）→离心分离→上清液→冻干→醇溶蛋白

1.3.2 玉米醇溶蛋白提取率测定

玉米醇溶蛋白提取率（%）=提取玉米醇溶蛋白质量（g）/玉米黄粉质量（g）×100%

1.3.3 玉米醇溶蛋白纯度测定

采用GB 5009.5-2016测定[19]。

1.3.4 响应面试验设计

乙醇浓度、固液比、pH、提取时间4 个因素为自变量，分别以x1、x2、x3、x4表示，根据现有试验条件及相关前期试验，确定其取值为60%～90%、1∶4～1∶13 g·mL-1、30～90 min。按方程Xi=(x1-x0)/Δx对自变量编码，并以自变量编码值+1、0、-1分别代表自变量高、中、低水平。玉米醇溶蛋白提取率YA为响应值，试验自变量因素编码及水平见表1。

表1 响应面试验自变量因素编码及水平Table 1 Code and level of independent variables in response surface test

1.3.5 DPPH自由基清除率测定

参照Zhang 等方法测定[20]，略有改动：新鲜制备DPPH 溶液（0.1 mmol·L-1），将其保存在盖有铝箔烧瓶中，两次测量之间保证4 ℃黑暗环境。在0.1 mmol·L-1DPPH 溶液中，将 2 mL 醇溶蛋白，加入到0.2 mL 提取液中并剧烈摇动。然后将试管在黑暗中放置室温30 min。同时制备DPPH 对照样品，并将乙醇用于空白。使用紫外可见分光光度计测量517 nm 处吸光度降低。记录吸光度降低百分比，基于观察到的自由基吸收度降低以计算DPPH自由基清除百分比。

1.3.6 ABTS+·自由基清除率测定

参照Al-Weshahy 等方法测定[21]，略有改动：通过将 ABTS 溶液（7 mmol·L-1）与 13.24 mg 过硫酸钾混合16 h，生成ABTS 自由基。将所得溶液冷藏、稀释，在734 nm 处吸光度为0.70。将100 mL样品与1.9 mL ABTS+·混合，然后放置7 min后，在734 nm处测量吸光度。

1.3.7 羟基自由基清除率测定

参照Fenton反应方法建立反应体系模型[22]，略有改动。反应混合物由10 mmol·L-1FeSO4-EDTA（0.15 mL），10 mmol·L-1H2SO（40.15 mL），0.15 mL H2O 和 0.15 mol·L-1磷酸钠缓冲液（pH 7.4，0.3 mL）。添加样品溶液（提取物，0.15 mL）后，将合并混合物在37 ℃下反应10 min，然后通过添加1%巴比妥酸（0.7 mL）和2.8%三氯乙酸（0.7 mL）终止反应。将该溶液在水浴中加热5 min，然后冷却至25 ℃。与抗坏血酸比较，在510 nm 处读取混合溶液吸光度（阳性对照）。根据以下方程式，以百分比形式分析影响。

1.3.8 自由基清除率计算公式

使用以下公式计算DPPH、ABTS+·、羟基自由基清除率。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.9 数据分析与处理

试验数据均平行测定3 次，采用Design-Ex⁃pert 8.0.6、SPSS 19.0软件分析所得数据。

2 结果与分析

2.1 提取温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响

在80%乙醇浓度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，超声波辅助处理30 min，分别在30～80 ℃下提取，研究温度对提取率的影响，结果见图1。

一般来说，温度升高有利于溶质宏观传质速率，温度较低时，提高温度增加分子动能，提高溶质扩散速率，增加醇溶蛋白提取率。由图1 可知，由30 ℃升至60 ℃时玉米醇溶蛋白提取率不断提高，当温度升至70 ℃及以上时提取率明显下降，产生这种现象可能是因温度过高导致部分蛋白变性，使醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解度降低。

图1 提取温度对玉米醇溶蛋白提取率的影响Fig.1 Influence of extraction temperature on the extraction rate of zein

2.2 提取时间对玉米醇溶蛋白提取率的影响

在80%乙醇浓度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，温度70 ℃，超声波辅助处理20～120 min 条件下提取原料，研究提取时间对提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对玉米醇溶蛋白提取率的影响Fig.2 Influence of extraction time on the extraction rate of zein

醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解及扩散均需一定时间，随提取时间增加，有利于蛋白质颗粒完全浸取，更易破坏醇溶蛋白和其他物质结合，促使在乙醇溶液中溶解，但随时间增加，浸取速度下降，提取率将逐步保持恒定。由图2可知，随超声时间增加，醇溶蛋白提取率逐渐增加，当提取时间增至80 min以上时，提取率增加缓慢。

2.3 乙醇浓度对玉米醇溶蛋白提取率的影响

在固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，温度70 ℃，超声波辅助处理80 min，乙醇浓度50%～100%条件下提取原料，研究乙醇浓度对提取率的影响，结果见图3。

图3 乙醇浓度对玉米醇溶蛋白提取率的影响Fig.3 Influence of ethanol concentration on the extraction rate of zein

由图3可知，随乙醇浓度增加，醇溶蛋白提取率先增后降，乙醇浓度为70%时提取率最大。此时因70%浓度乙醇极性与醇溶蛋白接近，根据相似相容原理，提取率达最大值。

2.4 pH对玉米醇溶蛋白提取率的影响

在固液比1∶10 g·mL-1，乙醇浓度70%，温度70 ℃，超声波辅助处理 80 min，pH 8～13 提取原料，研究pH对提取率的影响，结果见图4。

图4 pH对玉米醇溶蛋白提取率的影响Fig.4 Influence of pH on the extraction rate of zein

由图4 可知，不同pH 对醇溶蛋白提取率影响较大，随pH 逐渐增大，提取率呈先增后减趋势，原因可能为碱性条件有利于增加醇溶蛋白溶解性，但pH过高破坏蛋白质结构，反应在强碱条件下提取率反而下降的趋势。

2.5 固液比对玉米醇溶蛋白提取率的影响

在乙醇浓度70%，温度70 ℃，超声波辅助处理80 min，pH 11，固液比1∶8～1∶18 g·mL-1条件下提取原料，研究固液比对提取率的影响，结果见图5。

由图5可知，随固液比增加，醇溶蛋白提取率逐渐增加，原因在于随溶剂增加，醇溶蛋白大量暴露于乙醇水溶液，便于游离，但一旦溶剂溶解溶质达到饱和，提取率不再增加。

图5 固液比对玉米醇溶蛋白提取率的影响Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on the extraction rate of zein

2.6 玉米醇溶蛋白提取工艺模型建立及其显著性检验

利用Design Expert 8.0.6 软件建立试验设计及试验结果见表2。对表2 中试验数据作回归分析，得到二次多元回归方程（模型）为:

表3为模型方差分析结果，表4为模型显著性检验结果。对方程F检验可得出，失拟检验得到F失拟=0.52F0.01（14，4）=2.39，检验极显著，说明方程与实际情况拟合良好，可反映提取率与4 个因素之间关系，同时，复相关系数R2=0.9672，可分析和预测提取玉米醇溶蛋白提取工艺。

表4 为回归系数取值及方差分析结果，可知，x2、x1x4和x1x3项对提取率影响极显著，x1，x3x4对提取率影响显著，其他因素影响不显著。通过回归系数绝对值，得出提取率影响顺序为固液比>乙醇浓度>提取时间>pH。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surfacex test design and results

表3 回归模型显著性分析Table 3 Significance analysis of regression model

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Significance test of regression equation coefficients

2.7 玉米醇溶蛋白提取率中各因素交互作用分析

由图6 可知，pH 不变，随乙醇浓度增加，玉米醇溶蛋白提取率呈先增后降趋势；当乙醇浓度不变，pH 6～12 不断变化时，增大pH，提取率升高，当pH 达到中性时提取率增加趋于平缓并呈下降趋势，原因在于碱性条件有利于醇溶蛋白在乙醇溶液中溶出。

由图7可知，时间不变，随乙醇浓度增加，提取率呈先升后降趋势；当乙醇浓度恒定，时间在30～90 min 内变化，随时间延长提取率逐渐增加，最大提取率达22.51%，当时间达一定数值时，提取率趋于平缓。因本试验采用超声波辅助提取，超声波作用可有效打破溶质和溶剂边界层，加速媒介细化和混合，随时间增加，提高萃取速率。

图6 pH和乙醇浓度对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.6 Influence of pH and ethanol concentration on the extraction rate of isometric surface and response surface

图7 乙醇浓度、提取时间对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.7 Influence of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

由图8 可知，时间不变，随pH 逐步增加，玉米醇溶蛋白提取率液逐步增加，当pH达到一定值时，提取率呈下降趋势，这是由于玉米醇溶蛋白在中性或是偏碱性溶液中溶解性更好，酸碱性过强反而降低溶解度；当pH 不变，在30～90 min 范围内，随时间延长提取率增加，而当时间达到一定数值时，提取率呈下降趋势。

由图9 可知，当固液比不变，随乙醇浓度增加，提取率随之增加，而当乙醇浓度继续升高，提取率反而呈下降趋势。可能是由于含高比例非极性氨基酸玉米醇溶蛋白和其含有的其他氨基酸共同作用，在水或无水乙醇中的溶解度出现反复现象，随乙醇浓度变化，醇溶蛋白溶解性也发生改变；当乙醇浓度一定，固液比在4～13 g·mL-1内变化，随固液比增加玉米醇溶蛋白提取率逐渐增加。

由图10可知，pH不变，随固液比增加，玉米醇溶蛋白提取率逐步增加。因增加溶剂用量，有利于玉米醇溶蛋白在其中更充分溶解，然而不断增加溶剂用量，溶解度增长趋势急剧变小，从成本考虑，利用增加固液比提高产率并不经济；当固液比不变，pH 6～9 内变化，提取率不断增加，再持续增加pH，提取率呈下降趋势。

由图11 可知，当时间保持恒定，固液比增加，提取率逐步增加；当固液比不变，时间在30～90 min内变化，时间增加，提取率增加，当时间达到某一时刻，提取率呈轻微下降趋势。可能是由于时间增加，原料在溶剂中更好溶解，但提取时间过长，原料中蛋白发生变性等，亲水基团暴露，导致提取率出现下降。

图8 pH和提取时间对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.8 Influence of pH and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

图9 乙醇浓度、固液比对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.9 Influence of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

图10 pH、固液比对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.10 Influence of pH and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

图11 时间、固液比对提取率影响的等高面和响应曲面图Fig.11 Influence of extraction time and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

2.8 响应面方程验证

通过Design-Expert 软件得出最佳提取工艺为：乙醇浓度82.86 %，固液比1∶13 g·mL-1，pH 11.56，时间83.07 min，该条件下，提取率最大值为28.33%。根据实际操作，将最佳条件变为乙醇浓度80%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、提取时间83 min，实际提取率为27.87%，理论预测与实际提取误差为1.6%，此时醇溶蛋白纯度为92.47%。

2.9 提取醇溶蛋白抗氧化评价

对提取出的醇溶蛋白作DPPH、ABTS+·和羟自由基清除能力如图12～14所示。已提取醇溶蛋白具有清除3种自由基作用，浓度2～10 mg·mL-1时，对DPPH、ABTS+·和羟自由基清除率分别为30.12%～50.36%、20.12%～50.66%、22.12%～68.76%，抗坏血酸作为阳性对照其抗氧化能力如图所示。

图12 不同浓度醇溶蛋白和抗坏血酸对DPPH自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

图13 不同浓度醇溶蛋白和抗坏血酸对ABTS+·自由基清除率Fig.13 ABTS+·scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

图14 不同浓度醇溶蛋白和抗坏血酸对羟自由基清除率Fig.14 Hydroxyl free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

3 讨论与结论

从玉米蛋白粉中提取高品质玉米醇溶蛋白，有利于醇溶蛋白后续加工利用，传统工业主要以有机溶剂作为萃取剂，虽然丙酮和异丙醇提取效果略优于乙醇，但存在毒性较大，回收成本和损失率高等缺点，采用乙醇水溶液提取醇溶蛋白是目前主流提取方式[19]。

超声波辅助提取工艺，操作简单，热能消耗低，成本低，提取时间短，李丽杰等[11]，李娜等[23]，王缈等[24]，赵华等[25]，均利用超声波辅助提取方式优化玉米醇溶蛋白提取工艺，但在试验设计过程中pH 对试验结果的影响未纳入研究因素。Liu 等研究结果表明，碱性条件有利于醇溶蛋白在乙醇水溶液的提取[9]，本研究结果也表明，碱性条件下有利于提高提取率。

虽然和抗坏血酸比，提取得到的醇溶蛋白抗氧化能力有一定差距，但随醇溶蛋白浓度增加，对3种自由基的清除也逐渐提高，提取得到的醇溶蛋白具有较强自由基清除能力，可解释醇溶蛋白产生应用价值的原因，如油脂抗氧化性。在提取过程中不同提取条件改变醇溶蛋白微观结构，影响玉米醇溶蛋白提取工艺，因此，后续试验应对玉米醇溶蛋白在加工过程中结构变化和后续加工特性影响作为研究方向。

本文在单因素试验基础上，对提取温度、提取时间、pH、固液比和乙醇浓度因素作Box-Behnken响应面分析，得到最佳提取条件为，乙醇浓度80%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、超声时间83 min，提取温度70 ℃，各因素对提取率影响依次为固液比>提取率>乙醇浓度>提取时间>pH；采用DPPH、ABTS+·和羟基自由基3 种方法评价提取的玉米醇溶蛋白抗氧化能力，表明提取的玉米醇溶蛋白具有一定自由基清除能力。以上结果为进一步利用玉米加工副产物提供工艺参考，也为更好开发醇溶蛋白生物活性和加工领域提供参考。