circPUM1通过调控miR-524-5p表达对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响

李顺乐，张 迪，常 帅，李 华，赵 耀，吴 涛，陈 熹

西安交通大学第二附属医院普外科，陕西 西安 710004

结肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，近年来，我国结肠癌发病率与死亡率逐年增加，但结肠癌的发生机制尚未阐明[1]。研究表明，环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种非编码RNA，由于其具有闭合环状分子导致其具有高度稳定性，研究表明，circRNA可通过充当微小RNA(microRNA，miRNA)的海绵分子而抑制其表达从而调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移等生物学过程[2-3]。但circRNA在结肠癌中的研究相对较少。环状RNA PUM1(circular RNA PUM1，circPUM1)在肺癌、卵巢癌等肿瘤中呈高表达，并可促进肿瘤发生、发展[4-5]。StarBase预测显示，circPUM1与miR-524-5p存在结合位点，研究表明miR-524-5p在胃癌细胞中呈低表达并可影响细胞对顺铂的敏感性[6]。相关报道指出，miR-524-5p可抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡[7]。但circPUM1是否通过靶向调控miR-524-5p的表达影响结肠癌细胞的恶性生物学行为尚未可知。因此，本研究主要探讨circPUM1和miR-524-5p在结肠癌中的表达并分析其对细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响，以期为揭示结肠癌发生、发展的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人结肠癌细胞株SW620购自美国ATCC公司；杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；circPUM1小干扰RNA(si-circPUM1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)购自上海汉恒生物科技有限公司；circPUM1过表达质粒(pcDNA-circPUM1)和对照质粒(pcDNA)购自广州吉赛生物科技股份有限公司；miR-524-5p寡核苷酸模拟物(miR-524-5p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-524-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-524-5p)及阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)购自北京富龙康泰生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；兔抗人细胞周期蛋白1(Cyclin D1)、p21、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)抗体购自美国CST公司；兔抗人B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

结肠癌组织及癌旁组织标本来源：收集2017年10月至2018年12月本院收治的25例结肠癌患者为研究对象，所有患者均经病理证实为结肠癌，男18例，女7例，年龄(63.57±6.59)岁(50～72岁)。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；术前接受放疗或化疗患者。术中切除结肠癌组织及癌旁组织(≥5 cm)，置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染及分组：结肠癌细胞SW620置于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基内培养，培养条件：37 ℃、体积分数为5%的CO2，待细胞生长至80%融合度时进行传代培养。取对数期SW620细胞，质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×104个/ml，接种于6孔板(100 μl/孔)，待细胞生长至80%融合度时将培养基更换为不含血清的培养基，参照Lipofectamine2000转染试剂说明书分别将si-NC、si-circPUM1、miR-NC、miR-524-5p mimics、si-circPUM1与anti-miR-NC、si-circPUM1与anti-miR-524-5p转染至SW620细胞，分别记作si-NC组、si-circPUM1组、miR-NC组、miR-524-5p组、si-circPUM1+anti-miR-NC组、si-circPUM1+anti-miR-524-5p组。转染6 h后将培养基更换为含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h后收集细胞。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测circPUM1、miR-524-5p的表达水平：采用Trizol法提取结肠癌组织、癌旁组织及各组SW620细胞中的总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。按照反转录试剂盒说明书操作将总RNA反转录为cDNA。circPUM1正向引物：5′-ATGGGAGCAGCTCTTTGACT-3′，反向引物：5′-GACTCTCTCCTTGTGGCACT-3′；miR-524-5p正向引物：5′-CCAAAGGAAAAGAAGGCGCT-3′，反向引物：5′-AGCATCGATCCAGCCTAGTC-3′；6正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′， 反向引物：5′-GGAA-CGCTTCACGAATTTG-3′；GAPDH正向引物：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR检测，反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循环。circPUM1以GAPDH为内参，miR-524-5p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算circPUM1、miR-524-5p相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞增殖：收集各组对数期SW620细胞接种于96孔板(3×104个/孔)，每组设置3个复孔，转染24、48、72 h时向每孔加入20 μl MTT溶液，37 ℃培养箱继续培养4 h，经1 300 r/min转速离心5 min，弃上清，向每孔加入150 μl二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值(OD490 nm)。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率：收集各组对数期SW620细胞，加入预冷PBS，4 ℃条件下经1 000 r/min离心6 min(离心半径10 cm)，弃上清，加入预冷PBS，再次离心，弃上清，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，依次加入5 μl 膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)与5 μl碘化丙啶(PI)，室温振荡孵育10 min，于1 h内置于FACS Calibur流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移、侵袭：细胞迁移实验：收集各组对数期SW620细胞加入Transwell小室的上室(3×104个/孔)，含质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养液加入Transwell小室的下室(600 μl/孔)，37 ℃培养箱内培养24 h，PBS洗涤，采用多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察迁移细胞数。细胞侵袭实验：预冷培养液按照1∶8比例稀释Matrigel基质胶，加入Transwell小室的上室(40 μl/孔)，37 ℃培养箱孵育5 h，取各组对数期SW620细胞加入Transwell小室的上室(3×104个/孔)，后续实验步骤同细胞迁移实验，显微镜下观察侵袭细胞数。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测circPUM1的靶基因：StarBase预测显示，circPUM1与miR-524-5p存在结合位点，将含有结合位点的片段克隆至pmirGLO载体得到野生型载体WT-circPUM1，采用基因定点突变技术突变结合位点构建突变型载体MUT-circPUM1，分别将WT-circPUM1、MUT-circPUM1与miR-NC、miR-524-5p mimics共转染至SW620细胞，转染48 h，收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组细胞荧光素酶活性。分别将pcDNA、pcDNA-circPUM1、si-NC、si-circPUM1转染至SW620细胞，qRT-PCR检测各组细胞中miR-524-5p的表达水平。

1.2.7 蛋白免疫印迹(Western blotting)检测Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax蛋白表达：收集各组对数期SW620细胞，加入适量RIPA裂解液提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，质量浓度为50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗稀释液(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1 circPUM1和miR-524-5p在结肠癌组织中的表达与癌旁组织相比，结肠癌组织circPUM1的表达显著升高(P<0.05)，miR-524-5p的表达显著降低(P<0.05)(见表1)。

表1 circPUM1和miR-524-5p在结肠癌组织中的表达Tab 1 Expressions of circPUM1 and miR-524-5p in colon

2.2 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞增殖的影响与si-NC组相比，si-circPUM1组细胞活力显著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表达显著降低(P<0.05)，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)(见图1、表2)。

图1 增殖相关蛋白表达Fig 1 The expression of proliferation-related protein

表2 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞增殖的影响Tab 2 The effect of interference with circPUM1 expression on the proliferation of colon cancer SW620 cells n=9)

2.3 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响与si-NC组相比，si-circPUM1组迁移细胞数和侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)(见图2、表3)。

图2 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响 A：结肠癌SW620细胞的迁移、侵袭(200×)；B：迁移侵袭相关蛋白表达Fig 2 The effect of interference with circPUM1 expression on migration and invasion of colon cancer SW620 cells A: migration and invasion of colon cancer SW620 cells(200×); B: expression of migration and invasion-related proteins

表3 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响Tab 3 The effect of interference with circPUM1 expression on the migration and invasion of colon cancer SW620 cells n=9)

2.4 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞凋亡的影响与si-NC组相比，si-circPUM1组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)(见图3、表4)。

图3 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞凋亡的影响 A：细胞凋亡流式图；B：凋亡相关蛋白表达Fig 3 The effect of interference with circPUM1 expression on the apoptosis of colon cancer SW620 cells A: apoptosis flow cytometry; B: expression of apoptosis-related protein

表4 干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞凋亡的影响Tab 4 The effect of interference with circPUM1 expression on the apoptosis of colon cancer SW620 cells n=9)

2.5 miR-524-5p过表达对结肠癌SW620细胞恶性生物学行为的影响与miR-NC组相比，miR-524-5p组48 h、72 h细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数显著减少(P<0.05)(见图4、表5)。Western blotting检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-524-5p组细胞中Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)(见图5、表6)。

图4 miR-524-5p过表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭和凋亡的影响 A：结肠癌SW620细胞的迁移、侵袭(200×)；B：细胞凋亡流式图Fig 4 The effect of miR-524-5p overexpression on the migration, invasion and apoptosis of colon cancer SW620 cells A: migration and invasion of colon cancer SW620 cells (200×); B: flow cytometric diagram of cell apoptosis

表5 miR-524-5p过表达对结肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响Tab 5 Effects of miR-524-5p overexpression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis of colon cancer SW620 cells

图5 蛋白电泳图Fig 5 Protein electrophoresis diagram

表6 miR-524-5p过表达对结肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的影响Tab 6 The effect of miR-524-5p overexpression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis-related protein expression of colon cancer SW620 cells

2.6 circPUM1靶向调控miR-524-5p的表达StarBase预测显示，circPUM1的序列中含有与miR-524-5p互补的核苷酸序列(见图6)。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型载体WT-circPUM1的细胞中，miR-524-5p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.05)；转染突变型载体MUT-circPUM1的细胞中，miR-524-5p组荧光素酶活性与miR-NC组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表7)。qRT-PCR检测结果显示，与pcDNA组相比，pcDNA-circPUM1组细胞中miR-524-5p的表达水平显著降低(P<0.05)；与si-NC组相比，si-circPUM1组细胞中miR-524-5p的表达水平显著升高(P<0.05)(见表8)。

图6 circPUM1的序列中含有与miR-524-5p互补的核苷酸序列Fig 6 The sequence of circPUM1 contained a nucleotide sequence complementary to miR-524-5p

表7 双荧光素酶报告实验Tab 7 Dual-luciferase reporter assay n=9)

表8 circPUM1调控miR-524-5p的表达Tab 8 circPUM1 regulated the expression of miR-524-5p

2.7 抑制miR-524-5p表达逆转了干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞恶性生物学行为的作用与si-circPUM1+anti-miR-NC组相比，si-circPUM1+anti-miR-524-5p组细胞活力显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数显著增加(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平显著降低(P<0.05)(见图7～8、表9～10)。

图7 抑制miR-524-5p表达逆转了干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞迁移、侵袭和凋亡的作用 A：结肠癌SW620细胞的迁移侵袭(200×)；B：细胞凋亡流式图

of cell apoptosis

图8 蛋白电泳图Fig 8 Protein electrophoresis diagram

表10 抑制miR-524-5p表达逆转了干扰circPUM1表达对结肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达的作用Tab 10 Inhibition of miR-524-5p expression reversed the effect of interfering with circPUM1 expression on the proliferation, migration, invasion and apoptosis-related protein expression of colon cancer SW620 cells n=9)

3 讨论

circRNA在多种肿瘤中表达量异常且与肿瘤细胞恶性生物学行为有关，其基因序列中含有miRNA的反应元件，并可通过碱基互补配对原则吸附相关miRNA从而调控下游基因表达进而参与结肠癌等多种肿瘤发生过程[8-9]。既往研究显示，circRNA在结肠癌组织或细胞中异常表达并可能发挥抑癌作用或促癌作用[10-11]。但仍有部分circRNA在结肠癌发生、发展过程中的调控机制尚未阐明。因此，本研究积极探寻新型circRNA并分析其对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响，为结肠癌的靶向治疗提供潜在靶点。

circPUM1在肺腺癌中表达水平升高，并可通过竞争性结合miR-326从而促进肺腺癌发生、发展[12]。但circPUM1对结肠癌细胞生物学行为的影响尚未可知。本研究结果显示，circPUM1在结肠癌组织中呈高表达，与上述研究结果相似。提示circPUM1在结肠癌发生过程中可能发挥癌基因作用。本研究通过体外细胞实验证明，干扰circPUM1表达可明显抑制结肠癌细胞增殖，提示circPUM1表达量升高可促进结肠癌细胞增殖。研究表明，Cyclin D1在肿瘤细胞中高表达并可促进细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖，而p21可抑制细胞周期进程从而诱导细胞周期停滞于G1期，抑制细胞增殖[13]。本研究结果显示，干扰circPUM1表达可明显抑制Cyclin D1表达，促进p21表达，提示干扰circPUM1表达可能通过调控细胞周期相关蛋白表达从而抑制结肠癌细胞增殖。基质金属蛋白酶在肿瘤细胞迁移、侵袭过程中发挥重要作用，研究表明MMP-2、MMP-9属于基质金属蛋白酶类，其在肿瘤中表达量升高并可降解胞外基质沉积从而促进细胞迁移及侵袭[14]。本研究结果显示，干扰circPUM1表达后结肠癌细胞的迁移、侵袭能力明显降低，并可抑制MMP-2、MMP-9表达，提示干扰circPUM1表达可能通过下调MMP-2、MMP-9表达从而抑制结肠癌细胞迁移、侵袭。细胞凋亡在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用，研究表明，Bcl-2属于抗细胞凋亡蛋白，Bax属于促细胞凋亡蛋白，Bax表达量升高可促进细胞色素C转移至线粒体从而激活caspase级联反应最终诱导细胞凋亡[15]。本研究结果显示，干扰circPUM1表达后，结肠癌细胞凋亡率显著增加，Bax表达量升高，Bcl-2表达量降低，提示干扰circPUM1表达可能通过调控线粒体途径从而促进结肠癌细胞凋亡。

miR-524-5p可抑制胃癌细胞增殖及侵袭[16]。研究表明，lncRNA TUG1可通过竞争性结合miR-524-5p从而促进口腔鳞状细胞癌的发生及发展[17]。相关报道指出，miR-524-5p在甲状腺乳头状癌细胞中表达下调，上调miR-524-5p表达可抑制肿瘤发展进程[18]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，miR-524-5p在结肠癌组织中表达量降低，进一步研究显示，miR-524-5p过表达可明显抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，并可促进细胞凋亡，提示miR-524-5p在结肠癌发生、发展过程中可能发挥抑癌基因作用。为验证miR-524-5p调控结肠癌细胞生物学行为的机制，通过Western blotting实验分析显示，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2的表达量明显降低，p21、Bax的表达量明显升高，提示miR-524-5p过表达可通过调控细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达从而发挥作用。本研究结果显示，circPUM1可结合miR-524-5p从而调控其表达，进一步分析显示，抑制miR-524-5p表达可明显减弱干扰circPUM1表达对结肠癌细胞恶性生物学行为的作用，提示干扰circPUM1表达可通过上调miR-524-5p表达从而抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，并可诱导细胞凋亡。

综上所述，circPUM1在结肠癌中表达量升高，miR-524-5p在结肠癌中表达量降低，干扰circPUM1表达或miR-524-5p过表达可明显降低结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力，促进细胞凋亡，本研究证实circPUM1可竞争性吸附miR-524-5p从而负向调控miR-524-5p的表达，circPUM1可作为结肠癌诊断及治疗的分子靶标。