结直肠癌组织HHLA2、TMIGD2表达及其临床病理意义

谢瑞华， 季红莉， 付万发

北京老年医院消化科，北京 100095

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率及病死率随着人口老龄化加剧、人们膳食结构变化而呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌肿瘤远处转移是造成患者死亡的重要原因，虽然其诊断及治疗技术不断提高，但临床分期较晚的患者预后仍然较差[2]。因此，探索结直肠癌相关生物分子是结直肠癌研究的重要内容。人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2(human endogenous retrovirus-H long terminal repeat-associating protein 2，HHLA2)属于B7家族，是近年来新发现的B7家族免疫检查点分子成员，是肿瘤免疫治疗的靶点[3]。跨膜和免疫球蛋白结构域2(transmembrane and immunoglobulin domain containing 2，TMIGD2)是HHLA2的一个受体，与肿瘤密切相关[4]。孙琦等[5]研究表明，HHLA2、TMIGD2相互结合可促进肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤的进展和转移，HHLA2/TMIGD2有望成为肿瘤治疗新的通路和靶点。研究表明，程序性死亡因子1(PD-1)及其配体(PD-L1)与结直肠癌的发生发展有关，而HHLA2分子结构与PD-L1有一定的同源性和相似性[5-6]。因此,推测HHLA2、TMIGD2可能对结直肠癌的进展和转移有重要作用。然而HHLA2、TMIGD2与结直肠癌的关系有待进一步探究。因此，本研究通过探讨HHLA2、TMIGD2表达水平与结直肠癌临床病理特征及预后的关系，旨在为结直肠癌的治疗进展提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016年10月至2017年10月于本院住院治疗的168例结直肠癌患者肿瘤组织标本作为结直肠癌组，年龄(60.24±9.21)岁(42～76岁)，男82例，女86例；选取结直肠癌患者相应癌旁正常组织作为对照组。

纳入标准：(1)患者均经术后病理学检查确诊[7]；(2)病理组织标本及临床资料保留完整者；(3)术前未进行过放、化疗等治疗者；(4)经本院临床研究伦理委员会批准，所有研究对象均为自愿参加；(5)肿瘤远端距离肛缘≤10 cm者。排除标准：(1)有其他严重心、肝、肾等器质性病变或恶性肿瘤者；(2)有家族性息肉病、炎症性肠病等结肠病变者；(3)哺乳期、妊娠期妇女；(4)有细胞分子靶向治疗史者。

收集并整理所有受试者一般临床资料，主要包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、Duke分期、肿瘤分化程度。

1.2 主要试剂与仪器HHLA2抗体(货号：ATA30617)购自武汉益普生物科技有限公司；TMIGD2抗体(货号：H00126259-B01P)购自上海科敏生物科技有限公司；免疫组化试剂盒(货号：11719386001)购自德国罗氏公司。光学显微镜(型号：CX23)购自日本OLYMPUS公司

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存：采集结直肠癌患者手术时肿瘤组织及其癌旁正常组织。所有组织标本做相应处理，包括4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 HHLA2、TMIGD2蛋白水平测定：采用免疫组织化学法检测组织HHLA2、TMIGD2蛋白表达水平，具体操作方法按照免疫组化试剂盒说明书操作。结果随机选5个高倍镜视野观察，计数200个细胞，以胞浆内出现棕黄色或棕褐色为阳性细胞，阳性细胞数占总计数细胞的百分比作为阳性细胞比例。采用半定量法进行评分[8]，首先按染色强度计分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无色为0分；之后按照阳性细胞比例计分，阳性细胞比例1/3以下为1分，1/3～2/3为2分，2/3以上为3分。两次评分乘积为最终得分，≤2分为阴性表达，>2分为阳性表达。

1.3.3 随访：手术后3年内对所有患者采用电话、入户和患者入院复查等方式进行随访，术后平均每3～6个月随访1次。其生存期从手术之日起计算，随访截至2020年10月。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析数据，计数资料以例数/%表示，组间比较行卡方检验；采用Kaplan-Meier法分析结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2表达与预后的关系，用Log-Rank对生存曲线进行显著性检验，以α=0.05为检验水准；采用多因素Cox回归分析影响结直肠癌预后的因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和结直肠癌组HHLA2、TMIGD2表达水平比较结直肠癌组HHLA2、TMIGD2阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。免疫组化分析显示，HHLA2、TMIGD2在结直肠癌组织中均主要表达于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中(见图1)。

表1 对照组与结直肠癌组HHLA2、TMIGD2表达水平比较[例数(%)]Tab 1 Comparison of HHLA2 expression and TMIGD2 expression levels between control group and colorectal cancer group[n(%)]

图1 结直肠癌患者癌组织中HHLA2(A)、TMIGD2(B)表达(200×)

2.2 结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2表达水平与临床病理特征的关系根据结直肠癌患者肿瘤组织HHLA2、TMIGD2阳性表达情况，将其分为HHLA2阴性表达组(58例)、HHLA2阳性表达组(110例)，TMIGD2阴性表达组(72例)、TMIGD2阳性表达组(96例)。结果显示，HHLA2、TMIGD2阳性表达组与阴性表达组性别、年龄、肿瘤位置比较，差异无统计学意义(P>0.05)；HHLA2、TMIGD2阳性表达组与阴性表达组肿瘤直径、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、Duke分期、肿瘤分化程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2表达水平与临床病理特征的关系[例数(%)]

2.3 结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2表达水平与预后的关系采用Kaplan-Meier法分析结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2表达水平与患者3年生存率的关系，结果显示,HHLA2阴性表达的结直肠癌患者3年生存率(84.48%)高于HHLA2阳性表达患者(61.82%)，差异有统计学意义(χ2=9.227，P<0.05)；TMIGD2阴性表达结直肠癌患者3年生存率(80.56%)高于TMIGD2阳性表达患者(61.46%)，差异有统计学意义(χ2=7.097，P<0.05)(见图2～3)。

图2 结肠直癌患者HHLA2表达与预后的关系;图3 结肠直癌患者TMIGD2表达与预后的关系

2.4 影响结直肠癌预后的多因素Cox回归分析将结直肠癌患者是否发生死亡作为因变量，以HHLA2、TMIGD2、肿瘤直径、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、Duke分期、肿瘤分化程度为自变量进行多因素Cox回归分析，结果显示，HHLA2、TMIGD2、Duke分期是影响结直肠癌死亡的独立危险因素(P<0.05)(见表3)。

表3 影响结直肠癌预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

结直肠癌发病机制仍不十分明确，其发生发展涉及多个基因的表达失调或功能异常[9]。如何早期诊断以及预测结直肠癌不良预后，尽早采取干预措施，对降低患者死亡率至关重要[10]。临床研究表明，肿瘤直径、肿瘤位置、Duke分期、肿瘤分化程度等临床病理特征均是结直肠癌复发、转移及造成患者死亡的重要影响因素[11]。因此，探索与临床病理特征及预后相关的新分子标志物对结直肠癌早期干预、预后改善具有重要意义。

B7家族中许多成员已作为免疫检查点用于癌症的免疫治疗[12]。HHLA2作为B7家族重要成员，可与T细胞表面受体相互作用，在肿瘤微环境中可能发挥免疫调节机制[13]。HHLA2仅在一些组织的上皮细胞中表达，且在骨肉瘤、肺癌以及乳腺癌等多种癌症中高表达，其可能成为肿瘤相关治疗靶点[14]。TMIGD2是HHLA2的受体之一，广泛存在于B细胞、树突细胞、T细胞等免疫细胞中[15]。本研究结果中，HHLA2、TMIGD2在结直肠癌中均呈高表达。推测病理状态下，HHLA2、TMIGD2表达水平升高，而二者与免疫抑制作用密切相关，导致患者免疫功能下降，病情进一步恶化。孙琦等[5]研究显示，HHLA2与TMIGD2结合可促进肿瘤免疫逃逸，导致肿瘤转移。本研究中肿瘤直径≥5 cm、肿瘤浸润程度T4、出现淋巴结转移、Duke分期为Ⅲ期及Ⅳ期、肿瘤呈低分化的结直肠癌患者HHLA2、TMIGD2阳性表达比例较高。进一步提示HHLA2、TMIGD2的高表达可能与结直肠癌肿瘤转移、侵袭等恶性生物学行为有关。王泽群[16]研究结果表明，HHLA2可调节CD4和CD8 T细胞增殖，调节T细胞功能，与肿瘤发展密切相关。本研究结果中，HHLA2、TMIGD2阳性表达患者3年生存率低于HHLA2、TMIGD2阴性表达患者，且HHLA2、TMIGD2均是影响结直肠癌患者死亡的因素。提示HHLA2、TMIGD2高表达可能与结直肠癌的低生存率有关，推测HHLA2与其受体TMIGD2表达水平升高后，抑制CD4和CD8 T细胞增殖的作用增强，进而影响T细胞分泌某些细胞因子，造成患者免疫功能进一步下降，不良预后发生率升高。临床工作中可通过对HHLA2、TMIGD2表达情况进行检测，进一步有效评估患者临床分期等情况，预测患者不良预后，为临床治疗方案的确定提供参考。

综上所述，HHLA2、TMIGD2在结直肠癌患者肿瘤组织中高表达，且其高表达与肿瘤直径、肿瘤浸润程度、淋巴结转移、Duke分期、肿瘤分化程度等临床病理特征及预后不良有密切联系。HHLA2、TMIGD2可能作为结直肠癌治疗的新靶点，对于改善预后可能具有重要的参考价值。但作为回顾性研究，本研究中纳入样本量有限，HHLA2、TMIGD2参与结直肠癌发生发展的分子机制仍需细胞或动物实验验证，其临床应用价值仍需丰富样本量后进一步深入探索。