益气降浊汤对冠心病气虚血瘀型模型大鼠miR-126及Rho激酶表达的影响

王莹威,姜 晖,王 博,王 静

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

冠心病是由于冠状动脉粥样硬化导致血管狭窄或者堵塞引起的心肌细胞缺血损伤的一种心脏病，中医辨证多属气虚血瘀型，在各型冠心病中所占比例>10%[1]。MicroRNA(miRNA)是一种非编码的微小RNA，可参与人体多种代谢活动，miR-126是miRNA中含量较多的一类微小RNA，其具有抗动脉粥样硬化作用。冠心病患者miR-126表达水平降低[2]，miR-126水平增加可以促进受损心肌的修复[3]。Rho激酶是一种GTP结合蛋白重要效应分子，可以通过Rho/Rho激酶信号通路参与细胞的多种生理功能及细胞过程，Rho/Rho激酶信号通路与多种心血管疾病有密切关系[4]。近年来，中药在冠心病的治疗中发挥了重要作用，前期研究证实益气降浊汤治疗心血管疾病有较好疗效[5-7]。本研究通过建立冠心病气虚血瘀型大鼠模型，观察了其对miR-126及Rho激酶的影响，旨在进一步明确益气降浊汤的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF清洁级雄性Wistar大鼠48只,体重(200±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK(黑)2018-003。

1.2试剂及仪器 益气降浊汤由黄芪、莪术、苦参、川芎、当归、防风、丹参、桃仁、土茯苓、萆薢、茯苓、泽泻、牡丹皮、甘草组成，由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备。miR-126试剂盒购自上海科敏生物有限公司(DZT-ST600729)；RNA提取试剂Trizol 购自美国Uibco公司(10296010)；Rho激酶引物购自上海江莱生物有限公司(0-020225)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)试剂盒购自武汉纯度生物有限公司(批号分别为CD-1275-LIN， CD-1305-LIN， CD-0676-LIN)；注射用青霉素钠购自北京凯瑞基生物有限公司(CY16250)； DAB显色剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司(120390)。LH-PT动物实验跑台(南京卡尔文生物科技有限公司)；小动物专用吸入麻醉机(美国Matrx)；低温高速离心机(美国BECKMANCOULTER公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.3实验方法 将48只雄性SPF清洁级大鼠随机分成空白组、模型组、中药组、单硝酸异山梨酯组，每组12只，大鼠随意饮食饮水。大鼠适应性喂养7 d后，进行4 d的适应性跑台训练，每天1次，每次15～30 min。当大鼠能够以20 m/min的速度持续跑30 min后开始进行建模。淘汰不能完成上述运动的大鼠，最终每组纳入10只。在参考文献[8]的基础上进行改进，通过2周跑台运动建立大鼠疲劳运动模型后结扎冠脉：大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，气管插管，连接小动物呼吸机 (氧气压强0.1 MPa，氧气流量300 mL/min)，胸骨左缘第3～4肋间开胸，暴露心脏，在左心耳与动脉圆锥间用5-0手术线结扎，可见缺血区域变苍白，心电图示ST段弓背抬高，提示手术成功，然后挤压出胸腔空气并逐级缝合。缝合后注射青霉素160 IU/(kg·d)防止感染，连续3 d。空白组仅穿线不结扎。术后恢复4 d后开始进行力竭运动(速度20 m/min，频率1次/2 d)，造模时间为6周。造模完成后，中药组给予中药房煎煮好的益气降浊汤18 g/(kg·d)灌胃，单硝酸异山梨酯组给予单硝酸异山梨酯片6 mg/(kg·d)灌胃，模型组及空白组给予等量的生理盐水灌胃，均1次/d，连续4周。

1.4标本采集及检测

1.4.1血清指标 灌胃结束后，麻醉各组大鼠腹腔采血，4 ℃下13 000 r/min离心10 min后，取上清液，采用全自动生化分析仪检测血清CK、CK-MB、LDH水平，ELISA法检测血清TNF-α、IL-6、CRP水平。

1.4.2心肌组织HE染色病理观察 处死大鼠后取部分心肌组织，制备成石蜡切片后进行HE染色，于电子显微镜下观察心肌形态。

1.4.3心肌组织中miR-126及Rho激酶表达水平检测 取大鼠部分心肌组织，用Trizol方法提取大鼠心肌组织中的总RNA，反转录成cDNA，再进行PCR反应，计算miR-126及Rho激酶表达水平。miR-126引物：F5’-GCTGGCATTATTACTTTTGGTACG-3’,R5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’；Rho激酶引物：F5’-TCGGAATGATTCTCACTAA-3’，R5’-GCTTCACATGTCTCACTGC-3’。反应条件:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火,30 s，40个循环。U6作为miRNA的内参，基因表达结果均以2-△△ct进行分析。

2 结 果

2.1各组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平比较 模型组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明显高于空白组(P均<0.05)；中药组及单硝酸异山梨酯组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清CK、CK-MB、LDH水平比较

2.2各组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比较模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平均明显高于空白组(P均<0.05)；中药组及单硝酸异山梨酯组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠心肌组织HE染色表现 空白组大鼠心肌细胞形态正常，排列整齐，细胞间隙均匀；模型组大鼠心肌细胞肥大，心肌细胞坏死、排列紊乱，细胞核肿大变形，细胞间隙扩大，存在炎性浸润；与模型组比较，中药组及单硝酸异山梨酯组大鼠心肌细胞排列较整齐，炎性浸润程度减轻。见图1。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比较

2.4各组大鼠心肌组织中miR-126及Rho激酶表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠心肌组织中miR-126表达水平明显降低(P<0.05)，Rho激酶表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组及单硝酸异山梨酯组大鼠心肌组织中miR-126表达水平明显升高(P均<0.05)，Rho激酶表达水平明显降低(P均<0.05)。见表3。

3 讨 论

冠心病在中医上可归于胸痹心痛病，病位主要在心，与肝脾肾有关。该病病机是血脉瘀阻，病性为本虚标实，本虚指的是气血阴阳亏虚，以气虚为主，标实主要指气滞、血瘀、痰浊等，以血瘀为主，贯穿了冠心病发病的始终。20世纪70年代以来，以陈可冀院士为代表的科研团队提出了冠心病的基本病机是血脉瘀滞。随着研究的深入，一些学者开始从microRNA角度探讨冠心病的分型，为冠心病的分型提出了新思路[9],并提出了气虚血瘀、痰浊血瘀等更多的中医分型[10]。因此气虚血瘀成为冠心病心肌损伤的一个重要证候。益气降浊汤方中以黄芪为君，健脾益气；当归养血和血，川芎活血行气，莪术行气破血；丹参、桃仁活血化瘀止痛，瘀血祛则脉道通利；土茯苓、茯苓、萆薢、泽泻四者相须为用，淡渗利湿，使湿邪从下而走；苦参、牡丹皮清热凉血、养阴消瘀；甘草调和诸药。诸药相互配伍，既可健脾益气，又可活血通脉。现代药理研究表明，黄芪具有抗炎、抗氧化反应的作用[11],川芎具有抗动脉硬化、促进心肌细胞修复功能[12]，苦参具有抗氧化、抗纤维化、保护受损心肌细胞作用[13]。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色表现(×200)

表3 各组大鼠心肌组织中miR-126及Rho激酶表达水平比较

炎性反应是公认的冠心病病因之一，而miR-126可以抑制炎性因子，发挥抗动脉粥样硬化的作用，保护受损心肌[14]。王凤等[15]发现miR-126水平上调能够促进受损心肌修复和心肌细胞生成，减轻心肌受损。赵经纬等[16]证实Rho激酶抑制剂可以减轻炎性反应，保护受损心肌。李琴等[17]研究证明ROCKs拮抗剂能够抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡，减少炎性因子释放，保护受损心肌。TNF-α、IL-6、CRP是常用的评价炎性反应的指标，与冠心病发生、发展、预后密切相关[18]。本实验结果显示，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、CK、CK-MB、LDH水平及心肌组织中Rho激酶水平较正常组明显升高，心肌组织中miR-126水平较正常组明显降低，HE染色显示大量心肌细胞肥大、排列紊乱、炎性浸润，提示冠心病气虚血瘀型大鼠存在明显炎性反应，心肌出现损伤。与模型组相比，中药组及单硝酸异山梨酯组大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP、CK、CK-MB、LDH水平及心肌组织中Rho激酶水平明显降低，心肌组织中miR-126水平明显升高，HE染色结果较模型组改善，提示益气降浊汤可以抑制大鼠炎性反应，减轻心肌损伤。

综上所述，益气降浊汤可能通过提高miR-126水平及降低Rho激酶水平来抑制炎性反应，减轻大鼠心肌损伤，但是益气降浊汤对冠心病气虚血瘀型大鼠的心肌保护作用机制仍需进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。