磷霉素、多粘菌素B等抗菌药物对儿童感染NDM-1肺炎克雷伯菌的体外药敏研究

麦荣嘉 马丹娟 邓文喻 刘 倩 郑华仪 林鑫源 林雨诗

肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，KP）属革兰阴性杆菌，是人体上呼吸道和肠道的常见菌，可引起局部或全身性的感染性疾病。近年来肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率不断攀升，呈现世界性流行趋势［1-3］；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP），在我国流行情况也日益严重。碳青霉烯酶是一类可以水解碳青霉烯类活性的酶，按照氨基酸序列分为A、B、D类［4］。B类碳青霉烯酶又称金属β内酰胺酶，可以水解含有β内酰胺环的抗菌药物并且不被酶抑制剂所抑制，但可以被乙二胺四乙酸（EDTA）及巯基化合物等金属离子螯合剂所抑制［4-5］。根据基因序列的差异，肺炎克雷伯菌中检测到的金属酶主要有IMP、VIM和NDM等类型［4］。在国内，CRKP的流行主要以A类的产丝氨酸酶（KPC）和B类的产新德里金属β-内酰胺酶1型（NDM-1）多见，占全国CRKP的90%以上［3］。根据2019中国耐药网报道［3］，儿童医院分离的CRKP中，产NDM金属酶的肺炎克雷伯菌（NDM-KP）比综合性医院多见。现有临床研究结果显示，头孢他啶阿维巴坦能对KPC-KP有良好的抗菌活性，但是不能抑制NDM的水解活性对NDMKP感染治疗效果不佳［6］。目前，抗菌药物的联合使用是治疗NDM-KP感染的有效措施之一，而根据联合药敏试验结果选择治疗药物，对临床有效治疗NDM-KP具有重大的意义。因此，本研究使用浓度梯度扩散法药敏试剂对磷霉素、多粘菌素B、美罗培南和氨曲南以及联合对NDM-KP的作用，并探索方便、实用的浓度梯度扩散法联合药敏方法协助临床更好地防治NDM-KP感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床菌株的来源 2019年1—12月收集广东省妇幼保健院儿科PICU耐碳青酶烯类肺炎克雷伯杆菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）。菌株鉴定以及药敏试验由梅里埃VITEK2 Compact全自动分析系统完成。质控菌为ATCC700603肺炎克雷伯菌，由本院保存。

1.1.2 药敏试纸条 磷霉素药敏试纸条，多粘菌素B药敏试纸条，美罗培南药敏试纸条和氨曲南药敏试纸条（以上均来自温州市康泰生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 产金属酶肺炎克雷伯菌的耐药表型的验证 采用改良碳青霉烯类灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）联合乙二胺四乙酸改良碳青霉烯灭活法（eCIM）筛查产金属酶的碳青霉烯酶菌株，结果判断参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S30文件要求。

1.2.2 PCR验证 NDM有NDM-1～NDM-12等不同亚型，本实验参考文献［7］设计NDM基因的通用引物可以扩增含有NDM-1～NDM-12在内的NDM亚型的序列。参考文献［8-9］，设计磷霉素耐药基因FosA和多粘菌素B耐药基因mcr-1的特异性引物，引物序列及PCR反应条件见表1。PCR产物经纯化后由上海生工有限公司测序，应用Genebank进行比对分析。

1.2.3 药敏试验 采用浓度梯度扩散法法测定单药的MIC值浓度梯度扩散法试验按说明书操作测定MIC。基于CLSI 2020判读药敏结果。

1.2.4 联合药敏试验 试验组合如下，A组：磷霉素+多粘菌素B；B组：磷霉素+氨曲南；C组：磷霉素+美罗培南；D组：多粘菌素+氨曲南；E组：美罗培南+氨曲南。

1.2.5 分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration，FIC）计算 FIC的计算主要采用了MICA药联合和MIC B 药 联 合，FIC=MICA药联用/MICA药单用+MICB药联用/MICB药单用。在FIC≤0.5的情况下，此时就可以判断为存在着协同作用；在FIC在0.5～1.0的情况下，此时就可以判断为存在着部分协同作用；若存在着 FIC在1.0～4.0的情况，此时就可以判断为不存在相关作用；若存在着FIC＞4.0的情况下，此时就可以判断为存在着拮抗作用［10］。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行分析和处理，计量资料采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 NDM和FosA的引物

2 结果

2.1 NDM-KP耐药表型验证和PCR验证

根据mCIM以及eCIM试验结果，收集9株NDMKP菌株。运用NDM特异性引物，扩增以上9株肺炎克雷伯菌菌株，结果显示，其中8株肺炎克雷伯菌扩增出NDM特异性条带，见图1A。根据测序以及Genebank比对结果，均与NDM-1序列100%同源。而8株NDMKP均未扩增出磷霉素耐药基因FosA和多粘菌素B耐药基因mcr-1的特异性条带。

2.2 药敏试验结果

8株NDM-KP对美罗培南和氨曲南均耐药，MIC分别是8～32μg/mL和＞256μg/mL；而8株NDM-KP对多粘菌素B和磷霉素均敏感，MIC分别是0.25～1 μg/mL和4～32μg/mL（如图1B）。4种药物对NDMKP的MIC结果见表2。

2.3 联合药敏结果

联合药敏试验（如图1B-E）的FIC根据公式计算，A组FIC值范围在0.5～1.5，仅1株FIC为1.5，这种情况下就可以判定磷霉素联合多粘菌素B有部分协同作用，如图1C；C组联合用药 FIC值0.25～1，仅2株 FIC大于0.5，这种情况下就可以判定磷霉素联合美罗培南存在协同作用（如图1D），与其它组FIC值均具有统计学意义（P＜0.05），见图1F。而B组联合用药的FIC值为0.25～1.5，1株存在协同作用，3株有部分协同，其余均无相关。D组和E组联合用药的FIC值分别为1～2以及0.5～3，属无相关作用。

图1 NDM PCR鉴定、磷霉素联合药敏以及5组的FIC值

3 讨论

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，以CRKP为主的多重耐药菌被筛选出来［1-2］。根据报道，全球儿童感染携带NDM耐药基因的肠杆菌是以肺炎克雷伯菌为主，并呈明显上升趋势，这使得控制NDM-KP的感染迫在眉睫［1］。根据全国耐药监测网显示［3］，全国流行的CRKP主要分为KPC-KP和NDM-KP两种。与综合性医院相比，儿童医院分离的CRKP以NDM-KP较为多见［3］。在治疗NDM-KP引起的感染性疾病时，儿童的抗菌药物就具有较大的限制，给临床治疗带来了极大的困扰。NDM酶属于一种新型金属酶，可水解除氨曲南外的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物。本研究期间从儿科PICU患者临床标本中分离到8株NDM-KP均为NDM-1亚型，而上海地区的儿童医院分离的NDM-KP以NDM-5为主［11］，这可能与NDM地区流行差异有关。

NDM-KP的出现给人类健康造成了更加复杂和困难的挑战，对公共卫生安全构成越来越严重的威胁［12］。目前，针对NDM-KP的研究已经不少，但在临床上仍然缺乏有效的治疗药物和手段。现阶段临床主要采取联合用药方案治疗NDM-KP引起的感染，首选氨曲南联合头孢他啶阿维巴坦［13］，然而头孢他啶阿维巴坦在治疗儿童或新生儿的CRE的用药剂量以及疗效仍需进一步的探索。在大量临床研究基础下，国内专家共识推荐多粘菌素B药敏试验使用微量肉汤稀释法，而浓度梯度扩散法检测肺炎克雷伯菌时由于容易造成MIC值的下降，对携带mcr-1的肺炎克雷伯菌鉴定为假阴性［14］。本实验试验对耐药基因mcr-1的检测均阴性前提下，浓度梯度扩散法检测多粘菌素B的MIC发现多粘菌素B的MIC值在0.25～1μg/mL之间。然而多粘菌素B给药剂量需要达到负荷剂量和最大推荐剂量，并且对于肺炎的病患的全身给药亦可能无效［15］；副作用肾功能损伤以及神经阻滞等都限制了其在儿童的使用。

磷霉素作为一种广谱抗菌药物，主要以治疗大肠埃希菌和粪肠球菌所致非复杂性下尿路感染为医生所熟知。磷霉素主要有口服制剂和静脉制剂，除了常用于非复杂性下尿路感染的口服制剂磷霉素钙和口服制剂磷霉素氨丁三醇以外，静脉制剂磷霉素钠可以治疗如呼吸道感染、血流感染和中枢神经系统感染等系统性感染［16］。当前主要的争议在于，欧盟药敏试验标准（European Committee on Animicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）与美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）在磷霉素的折点上存在较大的差异。如治疗大肠埃希菌所致的尿路感染的磷霉素耐药标准，EUCAST标准和CLSI标准分别为MIC＞32 mg/L和MIC＞256mg/L；而CLSI甚至缺乏磷霉素对非尿路细菌感染的折点，这些都制约了磷霉素的应用。有研究显示，FosA3是介导KPC-KP对磷霉素耐药的主要机制，然而NDM-KP对磷霉素耐药机制报道甚少［17］。本研究结果显示，8株NDM-KP均未携带磷霉素FosA耐药基因，而且浓度梯度扩散法药敏结果MIC在4～32 mg/L之内，符合CLSI和EUCAST的对磷霉素敏感标准；同时C组的FIC在0.25～1范围内，结果显示磷霉素联合美罗培南存在协同作用，可以有效的抑制试验的8株NDM-KP。而联合多粘菌素B的FIC（A组）仅1株FIC大于1，可判断为有部分协同作用。过去，FIC的计算主要使用微量稀释法，但是该方法操作繁琐以及成本贵等原因，未能应用于普通临床实验室。本研究运用浓度梯度扩散法试验方法，其操作方便以及试剂的国产化降低的成本，能有效为临床提供联合用药的依据。

综上所述，如携带NDM或/和KPC等多重耐药的肺炎克雷伯菌不断增长、新抗菌药物研发无法满足需要的形势下，磷霉素和多粘菌素B或许成为临床抵抗耐药菌株的突破口。本研究发现磷霉素联合美罗培南或者多粘菌素B都对NDM-KP有良好抗菌活性，这提示其可能具有更广泛的临床应用范围。