2型糖尿病患者与健康人之间肠道菌群的对比分析

周强 徐静 蔡舒婷 熊红萍 俞冰鸿

近年来，青少年2型糖尿病的发病率呈现出逐年上升的趋势，这主要是由于人们生活水平有所提升，饮食结构不合理，除此之外，糖尿病的检测水平也是一项影响因素[1]。糖尿病成为新世纪以来的一项主要公共卫生问题，在这一情况下，世界范围内对糖尿病的病因、检测方式以及治疗方式进行研究，其中最关键的内容为微生物与糖尿病之间存在的联系[2]。有研究证明[3-4]，糖尿病与患者肠道菌群的种类以及数量有关。糖尿病患者肠道益生菌数量与自身血糖水平呈负相关。因此，需对糖尿病患者的肠道菌群进行研究，为早期检测，早期治疗提供依据。本研究对健康体检者以及2型糖尿病患者的肠道菌群进行对比，探讨其差异，明确糖尿病与肠道菌群之间的联系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取本院收治的20例青少年2型糖尿病患者作为观察组，另选取20例同期健康体检人员作为健康组，所有患者选取时间均为2019年3月—2020年3月，患者同意参与研究，签署研究同意书；医院医学伦理会审批通过本次研究。健康组中，男女比例为12：8，年龄15～39岁，平均（24.51±2.14）岁；观察组中，男女比例为14：6；年龄14～40岁，平均（25.34±1.12）岁；所有研究对象在1个月内均未接受抗生素进行治疗，不存在腹泻等胃肠道疾病，不存在明显肾脏功能缺陷以及肝脏功能缺陷，且不存在血液系统疾病以及其他内分泌系统疾病。所有参与研究人员的粪便标本均于清晨采集，且均于采集之后2小时之内放置于-80℃的超低温冰箱中备用。

1.2 方法

（1）粪便菌群DNA提取。采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取DNA，严格按照说明书操作，最后加入80μL的Buffer TE洗脱得到所需基因组DNA。

（2）PCR扩 增。PCR扩 增 体 系 为10×PCR buffer 5μL，5×Q solutuion 10μL；正向反向引物均为0.3μL，基因组DNA为5μL，d NTPs为0.2 mM，Mg Cl2为2 mM，Taq DNA聚合酶为2 U，添加无菌水，增加至50μL。PCR扩增条件：3 min 90℃，40个循环，3分钟72℃，正向引物、反向引物分别为：5-GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、5-TTACTCACCCGTCCGCCACT-3。采用生物素标记正向引物p BR5.SE 5端。

（3）16S r DNA文库建立。PCR产物采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳之后，割胶回收纯化目的片段，将其与p MD19T载体连接，转化感受态细胞，将其放置于培养基上，在37℃下进行16小时的培养，最后经蓝白斑进行筛选，挑出疑似阳性进行克隆，随手实施菌液PCR鉴定。鉴定结果为阳性的克隆子组建16S r DNA文库，在其中随机挑选30个进行测序。将最终测序结果与基因数据库进行比对。

表1 粪便菌群对比 [个（%）]

表1 （续）

表2 拟杆菌属及双歧杆菌属定量PCR对比（log N/g， ±s）

表2 拟杆菌属及双歧杆菌属定量PCR对比（log N/g， ±s）

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（4）焦磷酸测序。将47 μL的缓冲液与3 μL链亲和素包被磁珠添加至50 μL含有生物素标记的扩增产物中，并持续震荡混匀10 min，确保磁珠能够与PCR扩增产物充分结合，将焦磷酸测序仪中的配套单链分离钝化系统吸头置入混合液中，吸干液体之后，分别在浓度为70%的乙醇、变性缓冲液以及洗涤液中分别清洗带有磁珠的吸头5 s，释放磁珠至platelow板中，将platelow板放置于80℃的环境中变性，时间控制为2 min，取出冷却至室温状态。采用SQA模式的测序程序，将得出的测序结果与数据库序列进行对比，鉴定结果应为其余数据库序列100%匹配，本次采用的测序引物为p BR-V1.AS。

（5）定量PCR。分别采用相应的引物对拟杆菌和双歧杆菌属细菌进行定量PCR。PCR均采用的反应体系为25 μL，采用的反应程序为95 ℃ 1 min，95 ℃ 25 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组粪便菌群比较

从两组研究对象粪便提取细菌各600个，观察组的拟杆菌属、普氏菌属、灵芝菌属以及双歧杆菌属均多于健康组，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组可培养菌、普雷沃氏菌属明显少于健康组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组厚壁菌门和变形菌门各菌属对比差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 拟杆菌属及双歧杆菌属细菌定量PCR对比

观察组拟杆菌属及双歧杆菌属的定量PCR水平高于健康组（P＜0.05），见表2。

3 讨论

青少年2型糖尿病的主要发病因素为人体胰岛β细胞功能缺陷以及胰岛素抵抗[5]。如果人体血糖水平过高，胰岛β细胞就会通过分泌胰岛素的方式达到降糖目的，但如果胰岛β细胞功能存在缺陷，无法分泌胰岛素，降糖效用无法发挥，导致血糖升高[6-7]。人体自身的能量代谢与自身肠道内存在的微生物菌群之间存在密切联系，且肠道微生物菌群在人体消化吸收过程中也有一定作用，菌群种类以及数量的变化可能会导致机体发生代谢性疾病[8]。有研究指出[9-10]，人体的免疫系统、内分泌系统以及神经系统与体内各种微生物之间存在密切联系。肠道菌群大多存在与机体小肠以及结肠部位，在十二指肠、回肠上端以及空肠、胃部存在较少。肠道中的正常菌群能够在肠黏膜表面形成屏障，调节免疫功能，避免致病菌侵入。糖尿病患者由于代谢失调，其肠道菌群种类以及数量不同于健康人[11-13]。本研究结果显示，观察组患者的拟杆菌属、普氏菌属、灵芝菌属以及双歧杆菌属均多于健康组，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组患者的可培养菌、普雷沃氏菌属明显少于健康组，差异有统计学意义（P＜0.05）。观察组患者的双歧杆菌以及拟杆菌的定量PCR水平高于健康组，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示健康人群与糖尿病患者的不同属细菌分布存在显著差异，这样由于青少年2型糖尿病患者的糖代谢紊乱，使得肠道内耐受性较弱的菌群如可培养菌、普雷沃氏菌属等明显减少，随着患者的免疫力减弱，使得一些致病菌如双歧杆菌、拟杆菌等增多。因此，可证明青少年2型糖尿病患者肠道菌群处于失调状态。

综上所述，青少年2型糖尿病患者肠道菌群失调，这与血糖有一定关系，通过对比肠道菌群的差异能够为调节肠道菌群改善糖代谢提供依据。