PKM2在克罗恩病组织中的表达及意义

张 磊 杨 琳 王宏彬 周 怡

克罗恩病(CD)是一种炎症性肠病，目前病因尚未完全阐明[1]。CD的病变特点为肠道炎性反应迁延不愈，且多累及回肠末端，严重时可并发肠狭窄、梗阻、穿孔或肛周病变[2-3]。尽早评估CD患者疾病严重程度及预后对后续治疗具有重要意义。白细胞计数、C反应蛋白等炎性反应指标可评估CD疾病严重程度，但敏感度或特异度较低[4]。因此，亟需探究能够准确评估CD患者疾病严重程度及预后的生物标志物。肠黏膜在阻止胃肠道病菌侵入机体及维持全身免疫系统方面发挥着重要作用。CD发病时可使肠黏膜受损而发生炎性反应，致使肠上皮细胞凋亡。研究表明，M2型丙酮酸激酶(PKM2)的上调可通过调控B细胞淋巴瘤-XL(Bcl-XL)蛋白表达保护肠上皮细胞，使其免于凋亡[5]。本文检测了CD组织中PKM2蛋白的表达水平，并探究其评估CD患者疾病严重程度和预后的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2015年3月至2017年8月在上海市浦东新区浦南医院就诊的126例CD患者作为研究对象，设为CD组。根据《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》[6]中关于CD诊断的相关内容进行诊断。纳入标准：(1)年龄18～60岁；(2)接受结直肠镜检查；(3)签署了知情同意书。排除标准：(1)合并除CD以外的自身免疫性疾病；(2)入组前服用过抗炎药物；(3)合并严重心、肝、肾等脏器功能异常；(4)合并急性感染性肠炎；(5)合并恶性肿瘤；(6)不能配合随访。另选取同期在本院接受结直肠镜检查并切除肠息肉组织的52例患者作为对照组。CD组中男性81例，女性45例，年龄28～54岁，平均年龄为(40.25±5.45)岁；对照组中男性33例，女性19例，年龄29～50岁，平均年龄为(38.64±4.28)岁。两组的性别(χ2=0.011，P=0.917)、年龄(t=0.720，P=0.472)相比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集受试者的年龄、性别、吸烟史、病变位置、上消化道受累、C反应蛋白、红细胞沉降率、疾病行为和肛周病变等临床信息。C反应蛋白>8 mg/L定义为升高，红细胞沉降率>15 mm/h定义为升高。

1.2.2 PKM2蛋白表达水平检测 采用蛋白质印迹法检测CD组织及息肉组织中PKM2蛋白表达水平[7]。于结直肠镜检查时留取受试者CD组织和息肉组织的病理标本，将RIPA裂解液分别滴加至盛有CD及息肉组织的容器中，提取总蛋白，采用BCA法进行定量。然后，滴加匀浆缓冲液在4 ℃的离心机中以3 500 r/min离心15 min，取上清液。电泳100 min至溴酚蓝跑出胶面，缓冲液漂洗，浸入转膜缓冲液中转膜。PBS洗膜，加入兔抗人PKM2抗体(购自武汉益普生物科技有限公司)，4 ℃孵育过夜。PBST漂洗，加入山羊抗兔二抗(购自武汉益普生物科技有限公司)，室温孵育1 h。曝光显影，采用ImageJ软件进行光密度分析。

1.2.3 CD疾病严重程度评估 采用CD简化内镜评分(SES-CD)评估CD患者的疾病严重程度[8]。SES-CD评分将肠道分为末端回肠、右半结肠、横结肠、左半结肠和直肠5个部分，参考以下4个维度：溃疡大小、溃疡面积、受累肠道面积及肠腔狭窄情况，各维度评分均为0～3分，分数越高表示越严重。SES-CD 评分为各维度评分之和，0～3分为缓解，4～10分为轻度活动，11～19分为中度活动，20分及以上为重度活动。

1.2.4 预后评估 采用电话随访方式了解CD患者的预后情况。CD患者出院3个月后开始随访，了解其2年内的并发症、手术及CD相关死亡情况，随访终点为患者死亡或末次随访时间(2019年8月20日)。将发生肠瘘、复杂肛瘘、肠穿孔、消化道大出血、腹腔脓肿、肠梗阻等并发症，接受肠切除手术治疗，以及CD相关死亡判定为预后不良[9]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PKM2在CD组织中的表达

CD组PKM2蛋白的相对表达量为0.47±0.11，低于对照组(1.08±0.14)，两组差异有统计学意义(t=31.250，P<0.001)。

2.2 PKM2与CD疾病严重程度的关系

CD组患者平均SES-CD评分为(8.85±2.41)分。Pearson相关性分析结果显示，CD组患者PKM2蛋白表达水平与SES-CD评分呈负相关关系(r=-0.891，P<0.001)。见图1。

图1 PKM2与SES-CD评分关系的散点图

2.3 PKM2在不同预后的CD患者中的表达

随访发现，126例CD患者中有40例(31.75%)预后不良，包括5例(3.97%)肠瘘，6例(4.76%)复杂肛瘘，3例(2.38%)肠梗阻，4例(3.17%)腹腔脓肿，3例(2.38%)消化道大出血，19例(15.08%)接受肠切除手术治疗。预后不良的CD患者PKM2蛋白相对表达量为0.34±0.05，低于预后良好的CD患者(0.53±0.08)，两组差异有统计学意义(t=16.432，P<0.001)。

2.4 PKM2与CD患者预后的关系

预后不良患者和预后良好患者在年龄、性别、吸烟史、病变位置、上消化道受累、C反应蛋白和红细胞沉降率方面比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；在疾病行为和肛周病变方面比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

将可能与CD患者预后有关的因素，包括上消化道受累(非上消化道受累=0，上消化道受累=1)、疾病行为(非狭窄非穿透型=0，狭窄型=1，穿透型=2)、肛周病变(非肛周病变=0，肛周病变=1)和PKM2蛋白表达水平(原始值录入)作为自变量，纳入标准α≤0.1，将CD患者的预后情况作为因变量，纳入多因素Logistic回归模型分析，结果显示疾病行为、肛周病变和PKM2蛋白表达水平与CD患者预后关系密切(P<0.05)。见表2。

表1 影响CD患者预后的单因素分析

表2 影响CD患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨论

CD发病过程中，白细胞计数、C反应蛋白、血小板计数、红细胞沉降率、血红蛋白和白蛋白水平等炎性反应指标将发生变化，但上述指标在判断CD疾病严重程度方面存在不足，敏感度或特异度较低，临床价值有限[10-16]。结直肠镜检查是评估CD疾病严重程度的金标准，但患者接受度较低，操作较为繁琐，且难以多次进行。因此，探寻敏感度和特异度均较高且操作便捷的指标尤为重要。

PKM2是一种糖酵解关键代谢酶，在机体内以二聚体或四聚体形式存在[17]。二聚体的活性较低，主要存在于肿瘤细胞中；而四聚体的活性较高，主要存在于正常的、处于增殖状态的细胞中[18]。研究表明，PKM2可催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为乳酸，同时生成三磷酸腺苷，维持细胞增殖和代谢[19-21]。此外，PKM2还可以调控Wnt/β-catenin信号通路及Bcl-XL蛋白表达，从而抑制细胞凋亡[5,22]。

本研究结果显示，CD组PKM2蛋白的表达水平低于对照组，提示PKM2可能与CD的发病有关。SES-CD评分可反映CD患者的疾病严重程度。本研究发现，PKM2蛋白表达水平与SES-CD评分呈负相关关系，提示PKM2可能参与了CD的疾病进展过程。基于上述结果，本文比较了不同预后的CD患者PKM2蛋白表达水平，结果显示预后不良CD患者的PKM2蛋白表达水平低于预后良好者，提示PKM2与CD患者的预后密切相关。多因素Logistic回归分析结果显示，疾病行为、肛周病变情况和PKM2蛋白表达水平与患者的预后关系密切。

综上所述，CD患者PKM2蛋白表达水平越低提示其病情越严重。狭窄型或穿透型CD、合并肛周病变及低PKM2蛋白表达水平的CD患者发生预后不良的风险较高。检测CD组织中PKM2蛋白表达水平有助于评估CD患者的疾病严重程度和预后。本研究存在一定的不足之处，如入组患者的病程长短不一，可能使结果存在一定偏倚；未在治疗过程中检测CD组织中PKM2蛋白的表达水平，了解其动态变化及对疗效的评估价值。今后将针对以上不足开展多中心研究和基础研究，以阐明PKM2在CD发病及进展中的作用。