转移抑制性长链非编码RNA 对肺癌细胞增殖及凋亡的影响

宋淑范，王迪，陈德才

沈阳市第四人民医院，沈阳110031

肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均位居肿瘤性疾病的首位［1］。目前，肺癌的治疗效果仍不甚满意，其5 年生存率低于20%；因此研究肺癌的发病机制对于制定肺癌预防策略，探究新的治疗方法具有重要意义［2］。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200 nt 的内源性非编码的RNA 分子，它可以通过改变染色体构象、改变基因转录、基因翻译等起到调控基因表达的作用［3］。转移抑制性长链非编码RNA（lncRNA LIMT）是一种定位于12 号染色体的lncRNA，具有7 个外显子序列［4］。已有研究显示，在乳腺癌、肝癌中存在lncRNA LIMT 的低表达，其水平与患者预后相关，但在肺癌中的作用及机制仍未完全明确［5-6］。本研究探讨lncRNA LIMT 对肺癌细胞增殖及凋亡的影响，旨在为肺癌治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640 培养基，购自Gibco 公司；Liofectamine2000，购自Invitrogen 公司；lncRNA LIMT过表达质粒pEGFP-C1-LIMT、空质粒pEGFP-C1-NC、敲减质粒siRNA-LIMT 及其siRNA-NC，均购自于广州市锐博生物科技有限公司；CCK-8 细胞增殖实验试剂盒，购自于北京全式金生物有限公司；Annexin V-FITC/PI 双染凋亡试剂盒，购自于凯基生物有限公司；表皮生长因子受体（EGFR）蛋白一抗、磷酸化EGFR（p-EGFR）蛋白一抗、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）蛋白一抗、磷酸化ERK（p-ERK），购自于武汉三鹰公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取冻存的人肺癌A549 细胞，进行细胞复苏，复苏后重悬至含10%胎牛血清的RPIM1640培养基中，并在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下进行培养。在显微镜下观察A549细胞形态，并与说明书中的形态进行对比；当A549细胞融合度为95%时进行细胞传代，并取二代细胞进行试验。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期A549 细胞铺6 孔板，待A549 细胞融合度达70%～80%时应用lipofectamine 2000 分别转染lncRNA LIMT 过表达质粒pEGFP-C1-LIMT 及其空质粒pEGFP-C1-NC、敲减质粒siRNA-LIMT 及其空质粒siRNA-NC，并相应作为pEGFP-C1-LIMT 组、pEGFP-C1-NC 组、siRNA-LIMT组、siRNA-NC 组。所有操作按照说明书进行，转染后将6 孔板放入培养箱中细胞培养，培养条件为37 ℃、5%CO2浓度、饱和湿度。48 h 后可收集细胞，应用荧光显微镜检测细胞荧光验证其转染效率，并取细胞进行后续研究。

1.2.3 细胞增殖能力检测 用胰酶消化细胞，并应用PBS进行细胞重悬，收集各组细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，96孔板铺入各组细胞，100 μL/孔，每组设3个复孔，将96孔板放入培养箱中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2浓度、饱和湿度。分别于细胞转染后24、48、72 h向每个孔加入CCK-8细胞增殖检测试剂10 μL/孔，并用酶标仪检测450 nm处吸光值（OD450值）。

1.2.4 细胞凋亡检测 用胰酶消化细胞，并应用PBS重悬细胞。收集各组细胞，细胞计数后加入PBS调整细胞密度至1×106个/mL，加入100 μL 1×binding buffer，轻轻混匀后将各组细胞分别加入到1.5 mL的EP管中。避光条件下加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI staining solution 5 μL进行染色，轻轻混匀，室温下反应15 min。加入400 μL 1×binding buffer，1 h内应用流式细胞仪进行检测，检测结果以散点图呈现，其中右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。

1.2.5 lncRNA LIMT表达检测 采用RT-qPCR法。取各组转染的A549 细胞，经研磨后加入Trlzol 裂解液提取总RNA 分子，应用逆转录试剂盒进行发转录生成cDNA，并进行基因扩增。lncRNA LIMT 上游引物为5'-TTACCCACCCTACTTTCCC-3'，下游引物为5'-TTGTGCCCATCTACCAGG-3'，内参为β-actin，上游引物为5'-CACTGTCCCATCACGAGG-3'，下游引物为5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'，反应条件为：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，共40个循环，并应用2-ΔΔCt进行定量分析。

1.2.6 EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK 蛋白表达检测 采用Western boltting法。取各组转染的A549细胞，加入蛋白裂解液RIPA混匀后充分裂解，3 000 r/min离心10 min，离心半径6 cm。取上清后进行蛋白定量，然后进行电泳、转模、封闭等，加入EGFR 蛋白一抗、p-EGFR 蛋白一抗、ERK 蛋白一抗、p- ERK 蛋白一抗孵育过夜，TBST 冲洗，避光加入生物学二抗孵育1 h，以GAPDH 为内参应用Image Lab 软件测量蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0 统计学软件进行分析；计量资料符合正态分布以±s表示，多组比较采用方差分析，两两比较应用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力 CCK8 增殖试验显示，四组细胞增殖能力比较有统计学差异（P＜0.05）；pEGFP-C1-LIMT 组A549 细胞24、48、72 h 增殖能力均低于pEGFP-C1-NC 组（P均＜0.05），siRNA-LIMT 组A549细胞24、48、72 h增殖能力均高于siRNA-NC 组（P均＜0.05）。见表1。

表1 四组细胞不同时间点增殖能力比较（±s）

表1 四组细胞不同时间点增殖能力比较（±s）

组别细胞OD450值n 3 3 3 3 pEGFP-C1-LIMT组pEGFP-C1-NC组siRNA-LIMT组siRNA-NC组0 h 0.36±0.07 0.35±0.05 0.37±0.06 0.36±0.04 24 h 0.58±0.07 0.39±0.06 0.60±0.08 0.44±0.05 48 h 0.68±0.08 0.42±0.05 1.13±0.09 0.58±0.05 72 h 1.38±0.11 0.62±0.08 2.13±0.15 1.22±0.07

2.2 各组细胞凋亡情况 流式细胞仪检测显示，四组细胞凋亡情况比较有统计学差异（P＜0.05）；A549细胞凋亡pEGFP-C1-LIMT 组［（74.46 ± 4.28）%］高于pEGFP-C1-NC 组［（52.33 ± 5.23）%］（P＜0.05），siRNA-LIMT 组［（41.36 ± 4.23）%］低于siRNA-NC组［（52.54±4.88）%］（P＜0.05）。

2.3 各组细胞lncRNA LIMT 表达 RT-qPCR 检测结果显示，四组细胞lncRNA LIMT 水平比较有统计学差异（P＜0.05）；lncRNA LIMT 水平pEGFPC1-LIMT 组（12.78 ± 1.82）高 于pEGFP-C1-NC 组（0.94 ± 0.12）（P＜0.05），siRNA-LIMT 组（0.07 ±0.01）低 于 siRNA-NC 组（0.81 ± 0.16）（P＜0.05）。

2.4 各组细胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK 蛋白表达 Western boltting 检测显示，pEGFP-C1-LIMT组A549 细胞中EGFR、p-ERK 蛋白低于pEGFP-C1-NC 组，p-EGFR、ERK 蛋白高于pEGFP-C1-NC 组（P均＜0.05）；siRNA-LIMT 组A549 细胞中EGFR、p-ERK 蛋白高于siRNA-NC 组，p-EGFR、ERK 蛋白低于siRNA-NC 组（P均＜0.05）。见表2。

表2 四组细胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白表达比较（±s）

表2 四组细胞EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白表达比较（±s）

组别pEGFP-C1-LIMT组pEGFP-C1-NC组siRNA-LIMT组siRNA-NC组n 3 3 3 3 EGFR 1.35±0.15 3.28±0.21 4.23±0.32 3.07±0.23 p-EGFR 3.56±0.26 1.67±0.11 0.58±0.08 1.78±0.18 ERK 3.05±0.22 2.08±0.15 1.14±0.11 2.35±0.23 p-ERK 0.57±0.08 1.62±0.13 3.46±0.25 1.38±0.15

3 讨论

肺癌是起源于支气管黏膜和（或）支气管腺体的恶性肿瘤。根据《全球疾病死亡率及负担》研究报告显示，全球每年因肺癌死亡人数超过170万例，其中我国为55 万例，约占全球肺癌死亡人数的33%，占我国肿瘤死亡人数的25%［7］。大量研究显示，大气污染、吸烟、电离辐射以及反复发生的肺部感染、肺结核等均与肺癌的发生有密切关系［8-10］。临床上对于非小细胞肺癌仍主张早期进行手术切除治疗，但由于肺癌发病隐匿，大多数患者就诊时已处于晚期，丧失了手术治疗的机会。临床数据显示，对于Ⅰ期患者接受手术治疗后5 年生存率56%～73%，而晚期肺癌患者5 年生存率不足15%［11］，其中肺癌侵袭和转移是导致患者死亡的重要因素。肿瘤侵袭和转移过程是一个涉及多种基因异常表达的多因素、多步骤的复杂过程，研究肺癌发生、发展、侵袭和转移的分子机制有助于肺癌的早期诊断、制定新的治疗方案、明确预后等。

过去很长一段时间内，RNA 在人体基因表达中作用一直被忽视；直至人类基因组计划的完成，人们发现人类基因组中超过90%的基因为RNA 分子，其中仅2%的RNA 能够翻译为蛋白质，其余RNA 分子不编码蛋白质，被称为非编码RNA［12］。非编码RNA包括转录RNA、核仁小RNA、微小RNA 及lncRNAs等。起初人们认为lncRNAs是一类没有生物学功能的RNA 分子。近年来研究证实，lncRNAs 可以调控基因核内转运、干扰基因转录、参与染色质修饰等起到调控基因表达的作用，并参与了机体遗传、发育、细胞分化、细胞周期调控等众多生命活动［13-14］。lncRNA LIMT 是近年来新发现的一种lncRNA 分子，又称为LINC01089，是一种与肿瘤的发生、发展有密切相关的lncRNA 分子［15］。已有研究表明，lncRNA LIMT 可以抑制乳腺癌、肺癌的发生和发展。ZHAO等［16］报道，与正常乳腺细胞比较，乳腺癌MCF 细胞中lncRNA LIMT 表达下调，通过表皮生长因子刺激MCF 细胞可以导致lncRNA LIMT 进一步下调，并认为lncRNA LIMT可以通过抑制表皮生长因子起到抑制乳腺癌发生、发展的作用。王春刚等［17］研究发现，lncRNA LIMT 可以通过调控转化生长因子β 信号通路，抑制肺癌细胞恶性转变。但目前关于肺癌组织中lncRNA LIMT 表达情况及其对肺癌细胞增殖、凋亡影响仍缺乏相关报道。

为了研究lncRNA LIMT在肺癌中是否具有生物学功能，我们应用CCK8 试验观察不同组别A549 细胞的增殖能力，应用流式细胞仪观察不同组别A549细胞的凋亡能力。结果显示pEGFP-C1- LIMT 组A549 细胞增殖能力降低，凋亡比例升高，而siRNALIMT 组A549 细胞增殖能力升高，凋亡比例降低。表明lncRNA LIMT 具有抑制肺癌A549细胞增殖、促进其凋亡的作用。当lncRNA LIMT降低时可以引起肺上皮细胞、腺细胞增殖不受控制、凋亡受到抑制，并促进细胞恶变。本结果也提示通过对lncRNA LIMT进行调控可能是肺癌精准治疗的新策略。

目前已有研究表明，EGFR 信号通路在调节细胞和组织稳定中发挥重要作用［18］。EGFR 是上皮细胞增殖和信号传导的重要受体，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管生成及转移有密切关系。正常情况下EGFR 处于非磷酸化状态，当EGFR 发生磷酸化时可以导致其功能降低［19-20］。EGFR 突变也是肺癌发生的重要原因。研究表明，10%～44%的肺癌中存在EGFR 突变［21］。ERK 是MAPK 信号通路中的重要分子，具有调节细胞增殖、分化、维持组织正常形态的功能［22］。研究表明，当ERK 被磷酸化后可以激活MAPK 信号通路，并导致细胞进入G1期，细胞增殖速度加快，引起细胞恶变［23］。本研究结果显示，pEGFP-C1-LIMT组A549细胞中EGFR、p-ERK蛋白呈低表达，p-EGFR、ERK 蛋白呈高表达；与此相反，siRNA-LIMT 组A549 细胞中EGFR、p- ERK 蛋白呈高表达，p-EGFR、ERK 蛋白显呈低表达，表明lncRNA LIMT 可以促进EGFR 磷酸化，进而导致EGFR功能降低，抑制肺癌细胞的增殖。而lncRNA LIMT还可以通过抑制ERK 磷酸化，从而抑制MAPK 信号通路，并组织细胞进入G1期，起到抑制肺癌细胞的增殖，促进其凋亡的作用。

综上所述，lncRNA LIMT 在肺癌组织中低表达，lncRNA LIMT 可以抑制肺癌细胞的增殖，促进肺癌细胞凋亡，其机制可能与lncRNA LIMT 调控EGFGERK信号有关。