缺失突变型HBx 蛋白介导PDK2 在肝细胞肝癌中的差异表达及机制

张晶，毕利泉，曹瑞雪，姜贝贝，张自成，刘晓红

1 山东省立第三医院，济南250031；2 中国人民解放军联勤保障部队第960医院；3 深圳市中医院 广州中医药大学第四临床医学院

肝细胞肝癌（HCC）是我国第4 位常见的恶性肿瘤，其主要发病危险因素是乙型肝炎病毒（HBV）感染［1］。大量研究显示，乙型肝炎病毒X（HBx）基因编码的HBx 蛋白可以促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而加速肝癌的发展［2］。既往我们检测HCC 患者的肝癌组织及非癌性肝组织，发现HBx 蛋白羧基端的缺失突变是HBV相关HCC中的频发事件，并发现了一个HBx基因的天然缺失突变体HBx-128w，导致HBx 蛋白羧基端129-154aa 的缺失［3］。体外实验证实，缺失突变型HBx-128w较之野生型HBx具有更强的促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用［4］。2012 年3 月—2016 年10 月，我 们 构 建 了含HBx-128w 序列的真核表达载体，以空载体pcDNA3.1 为对照组，分别转染人肝癌细胞系Huh7，利用长链非编码RNA（lncRNA）芯片筛选相关差异表达基因，并初步探讨HCC 中差异基因丙酮酸脱氢酶激酶2（PDK2）表达的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系Huh7购自中国科学院细胞库；重组表达载体pcDNA3.1-HBx-128w 购自上海锐赛生物技术有限公司；真核表达载体pcDNA3.1和脂质体LipofectamineTM2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司；鼠抗HBxAg 单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的鼠抗兔IgG 二抗、ECL 化学发光检测试剂盒购自美国Santa Cruz 公司；兔抗PDK2 单克隆抗体购自英国Abcam 公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒购自上海碧云天公司；G418 培养液、胎牛血清、DMEM 培养液、Opti-MEM 培养液、胰蛋白酶、购自美国Gibco BRL 公司；聚偏二氟乙烯膜、Western 电转移系统购自美国Bio-Rad 公司；lncRNA Array v3.0 芯片购自美国Arraystar 公司；Trizol 试剂、SuperScriptTMⅢ逆转录酶购自美国Invitrogen 公司；RNeasy Mini Kit 试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.2 细胞转染与稳定转染细胞株的筛选 Huh7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，添加1%的青霉素和链霉素，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，隔天换液1 次，3～4 d 传代1 次。转染前24 h 用0.25%胰蛋白酶和0.02%二乙胺四酸二钠消化对数生长期的Huh7 细胞，以每孔3×105个接种于6 孔板，随机分为pcDNA3.1 组和HBx-128w 组，每组设3个复孔，转染前1 h 更换为Opti-MEM 培养液。取1μg 待转染质粒加入100μL Opti-MEM 培养液中混匀，室温孵育10 min；取3 μL Lipofectamine 2000试剂加入100 μL Opti-MEM培养液中混匀，室温孵育5 min；将两种稀释液充分混匀，室温静置30 min，加入DMEM培养液至1 mL。弃去6 孔板培养液，每孔加入1 mL转染液，置于培养箱中培养4 h。加入含20%胎牛血清的DMEM 培养液1 mL，24 h 后更换新鲜培养液。转染48 h 后，取1/3 的细胞加入含800 μg/mL G418的培养液，筛选出抗性克隆，之后降低G418 浓度至400 μg/mL维持扩大培养抗性克隆细胞。

1.3 细胞HBx 蛋白表达检测 采用SDS-PAGE 凝胶电泳及Western blotting法。取单层生长的两组稳转Huh7细胞及未转染Huh7细胞，PBS洗2次，加入SDSPAGE上样缓冲液，冰上孵育20 min，12 000 r/min离心2 min，收集上清。98 ℃水浴变性5 min，加样至10%的SDS-PAGE 凝胶加样孔内电泳（120 V）。使用电转移系统将分离胶上的蛋白质转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h，加入鼠抗HBxAg 单克隆抗体（1∶200），β-actin（1∶1 000）作为内参，4 ℃过夜。次日加入HRP 标记的二抗37 ℃孵育1 h，ECL 化学发光检测试剂盒显影成像。

1.4 细胞mRNA表达的LncRNA芯片检测 lncRNA Array v3.0 芯 片 包 括来 自Refseq、Gencode、UCSC knowngenes 等权威数据库和文献报道中的lncRNA，样本制备和芯片杂交根据制造商的标准协议进行。取稳转细胞1×106～1×107个，加入RNA 抽提试剂Trizol，裂解细胞后抽提总RNA。利用NanoDrop ND-1000 分光光度计和标准变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性和浓度。然后利用随机引物法，将每个样本扩增并转录成荧光cRNA。用RNeasy Mini Kit 试剂盒对标记的cRNA 进行纯化，将标记的cRNA 杂交到lncRNA 芯片上，芯片在65 ℃的滚动杂交炉Agilent Hybridization Oven 中孵育17 h。使用Agilent DNA 微阵列扫描仪扫描芯片，Agilent Feature Extraction 软件提取芯片数据，Agilent Gene Spring GX v11.5.1 软件进行原始数据的归一化和后续分析。筛选标准为Fold Change≥2.0及FDR≤0.05。

1.5 细胞PDK2 表达检测 采用RT-qPCR 方法，选取差异表达基因PDK2在稳转细胞中进行验证。利用Trizol 试剂及SuperScriptTMIII 逆转录酶进行样本总RNA的抽提及cDNA的合成，实时定量PCR反应在ViiA 7 Real-time PCR System 进行，引物设计软件Primer 5.0 设计双向引物序列如下：PDK2，F：5'- TCCAGCAATGCCTGTGAGAAA-3'和R：5'-TCGGGAAGCAGGTTGATCTC-3'；GAPDH，F：5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'和R：5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。根据梯度稀释DNA 标准曲线，各样本PDK2 和GAPDH 基因的浓度结果直接由机器生成，数据采用2-ΔΔCT法进行分析，重复3次。

1.6 PDK2 相关调控lncRNA 的生物信息学预测及验证 根据互作基因共表达网络寻找可能相关的lncRNA，并利用RT-qPCR 方法在稳转细胞中进行验证，引物设计软件Primer 5.0设计引物序列如下：lncRNA ENST0000511361，F：5'-TCCTGCTTAACCCTGCATTT-3'和R：5'-GGCAGTGATGTGGAGTCAGA-3'。其余步骤同前。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳转细胞HBx 蛋白表达 HBx-128w 转染组Huh7 细胞检测到HBx 阳性条带，而pcDNA3.1 空载体组和未转染组Huh7细胞无此条带，说明HBx蛋白在HBx-128w转染组Huh7细胞内高表达。见图1。

图1 两组细胞HBx蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

2.2 两组细胞mRNA 的差异表达 HBx-128w 组及空载体pcDNA3.1 组稳转细胞中共检测出mRNA 24 976个，lncRNA 36 629个。与pcDNA3.1组相比，HBx-128w 组差异表达的mRNA 数量为2 937 个，其中上调1 123 个（Fold Change：2.01～15.81），下调1 814 个（Fold Change：2.00～92.17）。 与pcDNA3.1 组相比，HBx-128w 组差异表达的lncRNA 数量为8 057个，其中上调2 986个（Fold Change：2.00～2578.19），下 调5 071 个（Fold Change：2.00～99.98）。在这些差异表达的mRNA中，PDK2显示为上调表达，Fold Change为3.219。

2.3 两组细胞PDK2 差异表达 RT-qPCR 结果显示，HBx-128w 组和pcDNA3.1 组PDK2 的相对浓度分别为4.823±0.497 和1.343±0.061；与pcDNA3.1组相比，HBx-128w 组PDK2 的浓度升高（P＜0.05），两组间差异倍数为3.591。

2.4 PDK2 相关调控lncRNA 的差异表达 RT-qPCR 结果显示，HBx-128w 组和pcDNA3.1 组lncRNA ENST0000511361 的相对浓度分别为4.790±0.364和1.280±0.066，与pcDNA3.1 组相比，HBx-128w 组lncRNA ENST0000511361的浓度升高（P＜0.05），两组间差异倍数为3.742，与PDK2差异表达的趋势一致。

3 讨论

研究表明，HBx 蛋白的氨基端（1-50aa）是负功能调控区，可以抑制HBx 蛋白的反式激活功能，而羧基端（51-154aa）为反式激活区，该区域的105-148aa是HBx 蛋白发挥反式激活功能的结构基础［5］。肝癌组织中普遍存在着异质的HBx 羧基端缺失突变体，表达截短的HBx 蛋白，导致其反式激活能力下降，同时丧失了野生型HBx 抗增殖和促细胞凋亡以及抑制细胞转化的作用［6］。HBx 蛋白任何区域的缺失都可能改变其与细胞增殖、转化、反激活或转录调控相关的生物学功能。之前我们构建了不同长度的HBx 羧基端缺失突变体，结果显示它们对肝癌细胞的生物学行为有着不同的影响［7］。对人HCC组织中HBx 羧基端缺失突变体的研究显示，与野生型HBx 相比，缺失突变体通过复杂的分子调控网络促进了肝细胞的恶性转化［8］，但是其确切的分子机制仍需深入研究和充分阐明。

相关研究表明，即使在氧含量正常的情况下，肿瘤细胞也以糖酵解途径作为主要的能量来源［9］。丙酮酸脱氢酶激酶（PDKs）作为有氧糖酵解途径的重要调节酶，在某些病理条件下被激活，可能通过影响有氧糖酵解改变细胞的代谢，参与细胞的恶性转化。PDKs 有PDK1、PDK2、PDK3、PDK4 四种亚型，其中PDK2 几乎在所有组织中表达，尤其是肝脏和肾脏［10］。近年来，PDK2 与肿瘤的关系受到关注。研究显示，PDK2 在多种肿瘤中异常过表达，与肿瘤的恶性表型密切相关［11］。一项研究发现，PDK2 在胆管癌组织中强阳性表达，在癌旁组织中呈弱阳性表达，两者有显著差异［12］。本研究的lncRNA芯片结果显示，PDK2 在缺失突变型HBx 转染的Huh7 细胞中上调表达；之后的RT-qPCR 试验结果显示，与空载体pcDNA3.1 组相比，HBx-128w 组稳转细胞中PDK2 的表达显著上调，这与芯片结果一致，提示HCC 组织中，缺失突变型HBx 参与调控了PDK2 在转录水平的表达，可能通过改变肝癌细胞的代谢，加速了HCC的演进。

PDK2 调控肿瘤发展的机制涉及多个方面。有研究发现，PDK2 在HCC 中高表达，与miR-214 呈负相关，下调PDK2 可以显著抑制HCC 细胞的增殖和迁移［13］。还有人发现，抑制PDK2 活性可以抑制磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B 通路的激活，从而抑制肿瘤细胞的生长［14］。现有对PDKs 抑制剂的研究发现，PDK2 的过表达是癌细胞获得性耐药的重要机制，下调PDK2 能够提高癌细胞对化疗药物的敏感性［15］。lncRNA 是一种长度超过200 个核苷酸、编码蛋白能力较低或不具有编码蛋白能力的RNA 转录本［16］，具有复杂的二级空间结构，可以为蛋白质提供多个结合位点，形成复杂精细的基因表达调控网络。现有研究表明，lncRNA 与人类肿瘤密切相关，lncRNA 的异常表达在包括HCC 在内的许多肿瘤中都有发生［17］。目前已发现多种lncRNA 在HBV 相关的HCC中异常表达，参与调控HCC的发展［18］。大部分研究也表明lncRNA受到HBx的调控；通过加速肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，或通过调节多种蛋白编码基因、miRNA 和信号通路的表达来减少细胞凋亡，从 而 促 进HCC 的 进 展［19-20］。本 研 究 通 过 对mRNA 和lncRNA 表达谱的交集分析和生物信息学预测，发现lncRNA ENST0000511361 可能参与HCC发展过程中PDK2 表达的调控，RT-qPCR 结果显示HBx-128w 组稳转细胞中lncRNA ENST0000511361表达量较pcDNA3.1 组明显升高，这与PDK2 的RTqPCR 结果一致。未来我们将通过体外实验对该lncRNA的功能进行深入研究。

综上所述，我们利用lncRNA芯片筛选了缺失突变型HBx 转染的肝癌细胞中差异表达的基因，发现了PDK2 在Huh7 细胞中上调表达，并通过RT-qPCR验证了芯片结果。提示HCC 组织中，HBx 蛋白可以通过羧基末端的缺失突变，改变其生物学功能，调控PDK2 的异常表达，促进HCC 的发展。这一过程涉及到许多因素，其中lncRNA ENST0000511361 可能是一个重要的调控靶点。