胃癌组织中miR-184、Beclin1、LC3B 的表达及临床意义

刘丽霞，张路，杨丽

石家庄市中医院，石家庄050000

胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤，其死亡人数位居消化道恶性肿瘤首位，且发病率仍呈居高不下的趋势［1］。因此，探索胃癌发展相关机制，找寻其中关键基因，对靶向治疗及研发药物具有重要作用。微小RNA（miRNA）是由前体RNA 经核糖核酸内切酶裂解后形成的非编码RNA，能够参与胚胎发育、免疫应答、炎症应激以及细胞分化等生理过程。miR-184 失活后能够阻遏磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN），而PTEN 作为一种抑癌基因，其活性下降后使胶质瘤细胞的增殖及分化能力增强，促进癌症进展［2］。对于自噬在肿瘤中的具体作用目前尚有争议［3］。Beclin1是酵母自噬相关基因（ATG）6 的同系物，位于人类染色体17q21 上，目前被广泛认为是一种抑癌基因，参与调控自噬过程［4］。在结肠癌组织中，Beclin1失活能够诱导噬底物P62聚集，通过NF-kβ 信号转导通路转导，促进结肠癌的进展［4］。微管相关蛋白1 轻链3B（LC3B）是ATG8 的同源基因，位于内层自噬泡，其含量与自噬的活性呈正相关［5］，不同癌症组织中的LC3B 表达存在较大差异［6-7］。研究发现，miR-30a是调控自噬的关键基因，与Beclin1具有显著相关性［8］，但是miR-184是否同样具有调控自噬的功能尚不清楚，与Beclin1和LC3B的相关性尚未可知。因此，笔者对胃癌组织中miR-184、Beclin1、LC3B的表达及临床意义进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本院2018 年1 月—2020 年6 月收治胃癌患者103 例，男60 例、女43 例，年龄（58.32±9.88）岁；有淋巴结转移者21例，无淋巴结转移者82例；有Hp 感染者70 例，无Hp 感染者33 例；低分化9例，中分化41 例，高分化53 例；肿瘤长径≤3 cm 者53例，肿瘤长径＞3 cm 者50 例；TNM 分期Ⅰ期42 例、Ⅱ期48 例、Ⅲ期8 例、Ⅳ期5 例。纳入标准：①符合国际抗癌联盟及美国肿瘤联合会胃癌的诊断准则［9］，且术后病理确诊为胃癌；②患者均为首次确诊，且既往无胃部手术史或放化疗史；③全部患者均自愿协助参与本次研究，且临床资料齐全。排除标准：①合并胃部间质瘤、淋巴瘤及神经鞘瘤等肿瘤者；②合并胃穿孔或出血者；③重度肝硬化或慢性肾功能不全者；④合并其他原发恶性肿瘤者；⑤先天免疫系统缺陷者。本研究由医院伦理委员会批准实施，胃癌患者均已签署知情同意书。

1.2 研究方法 采用荧光实时定量PCR 技术检测miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达。术中采集胃癌组织及其癌旁正常胃组织（距癌组织5 cm 处）放入液氮罐中暂存，术后置于-80 ℃冰箱中冷冻保存。两种样本各采集30 mg，将其剪碎滴加裂解液Trizol 试剂（Invitrogen 公司；批号20181226）后研磨。采用RNA抽提试剂盒（购自大连TaKaRa 公司，批号：20181223）提取总RNA，遵循操作步骤依次进行。总RNA通过逆转录试剂盒（购自BioRad公司，批号：20181230）逆转录为cDNA。通过SYBR Green Supermix Kit 试剂盒（购自BioRad 公司，批号：20181211）定量检测miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量。miR-184、Beclin1 及LC3B 的 反 应条件均为42 ℃30 min、85 ℃5 min。PCR 扩增体系为：正向引物1μL、反向引物1 μL、cDNA 3.0 μL、SYBR Green Supermix Kit10 μL 以及dH2O 5.0 μL，共计20 μL。miR-184 的正向引物序列为5'-GCTAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3'、反向引物序列为5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。Beclin1 的 正 向 引 物序列为5'-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3'、反向引物序列为5'-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3'。LC3B 的正向引物序列为5'-GAAGATGTCCGATCTATTCGAGAG-3'、反向引物序列为5'-ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG-3'。 GAPDH 正向引物序列为5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'、反向引物序列为5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。引物序列上海吉玛生物公司合成制作。miR-184、Beclin1 及LC3B 的PCR 反应均为40 个循环，反应条件均为预变性95 ℃30 s、变性95 ℃10 s、退火60 ℃15 s、延伸72 ℃1 min，样本均设置3 个复孔。以相对Ct值法检测miR-184、Beclin1及LC3B的表达量，将ΔCt 值作为结果，相对于内参基因GAPDH 的比值为2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较应用独立样本t检验，多组间比较应用方差分析。相关性检验应用Pearson 相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1 及LC3B 表达 胃癌组织中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量较癌旁组织下降（P均＜0.05）。见表1。

表1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1及LC3B表达比较（± s）

表1 胃癌及癌旁组织miR-184、Beclin1及LC3B表达比较（± s）

组别癌组织癌旁组织n 103 103 t P miR-184 1.85±0.67 3.21±1.02 11.310＜0.05 Beclin1 0.86±0.33 1.69±0.75 10.280＜0.05 LC3B 0.61±0.28 1.77±0.56 18.803＜0.05

2.2 胃癌组织中miR-184、Beclin1 及LC3B 的表达量与临床病理参数的关系 胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达与淋巴结转移和TNM分期有关（P均＜0.05），而与患者性别、分化程度、年龄、Hp感染及肿瘤大小无关（P均＞0.05）。见表2。

2.3 胃癌组织miR-184、Beclin1 及LC3B 表达的相关性 胃癌组织miR-184表达量和Beclin1表达量呈正相关（r=0.845，P＜0.05），miR-184 表达量和LC3B表达量呈正相关（r=0.787，P＜0.05），Beclin1 表达量和LC3B表达量呈正相关（r=0.793，P＜0.05）。

3 讨论

据循证医学统计，饮食习惯和地域差异是胃癌起病的重要危险因素。目前，临床治疗胃癌的主要方式是以手术为主、放化疗为辅的方案，但胃癌极易通过淋巴结或直接侵袭周围脏器发生转移，从而使患者的预后生存时间缩短。近年来，人类依靠基因测序技术对基因及其功能的研究逐步深化，基因在肿瘤的发生发展中所起到的作用逐渐被人们熟知。既往研究表明，DNA 甲基化、外泌体、LncRNA 以及miRNA 等因素能够阻遏或诱导原癌基因的表达，从而使细胞发生异常分裂及分化，对肿瘤的演变具有至关重要的作用［10-12］。

表2 胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达量与临床病理参数的关系

miRNA 广泛存在于真核生物中，其功能和序列具有高度保守性，通过调控多种靶基因及信号通路，参与肿瘤细胞分裂、分化及侵袭等过程。miR-184位于9 号染色体，最初在大鼠的小脑和心脏中被发现，能够调控血管源性疾病中新生血管的产生。在青光眼、白内障等疾病中，miR-184 通过调控免疫细胞分裂和凋亡使机体发生不同程度的氧化应激反应，导致视觉神经细胞受损［11］。在肾细胞癌组织中，miR-184能够结合红细胞膜蛋白带4.1类似物5的3，端，使其表达产物失活，从而调控癌症进展［10］。研究表明，miR-184 能够靶向结合丝氨酸/苏氨酸激酶基因，使胶质瘤细胞分裂受阻，同时促进胶质瘤细胞凋亡，使其侵袭能力下降［12］。本研究表明，胃癌组织中miR-184 的表达量较癌旁组织下降，其机制可能为癌细胞内的miR-184 自身发生甲基化，启动子沉默，从而导致miR-184表达下调；胃癌组织中miR-184的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关，其机制可能为miR-184表达受阻诱导胞外信号调节激酶1活化，通过转移翻译其表达产物增加，从而使癌细胞周期缩短，分裂分化加快［12］。此外，下调的miR-184 通过激活肿瘤坏死因子-α，使血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子2 活化，促进癌细胞周围形成肿瘤新生血管，增强其转移和侵袭能力［11］。

自噬是一种高度保守的生理活动，在保障机体的正常生命活动、清理异常细胞和病原体等方面发挥关键作用［3］。自噬功能受损或缺陷能够损伤线粒体并产生大量的分子活性氧，从而使DNA 突变及染色体异常的风险增加［6］。Beclin1是组成自噬核心复合物的重要元件，能够结合Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶形成复合体，通过转换ATG蛋白在自噬前体的位置，调控自噬的活性［13］。既往研究表明，Beclin1 在乳腺癌组织中表达缺失，而上调其表达后能够定向破坏癌细胞，抑制其生长［14］。药物研究表明，Beclin1 高表达的癌细胞对顺铂的敏感性较高，使癌细胞凋亡的速度明显加快。本研究表明，胃癌组织中Beclin1的表达量较癌旁组织下降。其机制可能为癌细胞中Beclin1常呈单染色体缺失，使自身沉默子活化，导致Beclin1表达下调［15］；胃癌组织中Beclin1 的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关，其原因可能为Beclin1下调后能够诱导噬底物p62不断聚集，通过核转录因子信号通路的传导使快速癌细胞异常增生及分化［15］。同时，失活的Beclin1 通过调控凋亡基因的BH3 区域，使癌细胞逃避快速凋亡程序，转移和侵袭能力增强。

LC3 是一种重要的自噬体结构，包括Ⅰ型和Ⅱ型，主要存在于细胞质的自噬体膜上，与自噬功能密切相关［7］。自噬启动时LC3A 的启动子活化，生成的LC3A 靶向结合磷脂酰乙醇胺形成LC3B，对自噬活性的判断具有高度特异性。邓淑文等［16］在药物试验中发现，姜黄素通过上调LC3B表达使癌细胞增殖速度降低，并抑制其分裂。在非小细胞癌组织中，中成药物联合铂类药物能够激活LC3B，启动自噬机制，使机体内的自噬活动增强［17］。本研究表明，胃癌组织中LC3B的表达量较癌旁组织下降，其机制可能与癌细胞内免疫系统异常导致使自噬体溶解有关，而LC3B主要存在于自噬体膜上［7］；胃癌组织中LC3B的表达与淋巴结转移和TNM 分期有关，其原因可能为LC3B下调后使机体自噬活性降低，诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达，激活AMP依赖的蛋白激酶，使癌细胞的分裂速度明显加快，同时诱导癌细胞发生上皮-间质转化，从而加强癌细胞的侵袭性［5，18］。

本文相关分析显示，miR-184和Beclin1、miR-184和LC3B、Beclin1和LC3B的表达量均呈正相关，提示miR-184、Beclin1及LC3B在胃癌中发挥的作用相似，均对胃癌的演变起到一定作用。miR-184 能够调控PI3K/Akt信号通路，而该通路是调节自噬活性的重要途径，Beclin1和LC3B均是自噬过程中的重要环节，这可能是miR-184、Beclin1 及LC3B 之间具有相关性的重要原因［19-20］。总之，胃癌组织中miR-184、Beclin1及LC3B的表达均降低，且与淋巴结转移和TNM分期密切相关，能够在一定程度上评估患者病情。