肿瘤间质比在Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者预后评估中的价值

李腾飞 杨彦 黄陈

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球范 围内最常见的肿瘤之一［1］，据中国国家癌症中心2015年的癌症统计数据显示，CRC的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中分别位居第3位和第5位，Ⅱ期CRC比例约占25%，其中约15%～25%的患者出现复发［2］，且大约有1/5的患者在首诊时就存在着远处器官转移［3］。目前国际上统一使用TNM病理分期系统，但是出现了同一分期的不同患者预后有差异，ⅡB期患者的预后比ⅢA期患者差，在某些情况下导致Ⅱ期患者治疗不足，Ⅲ期患者治疗过度的情况。上述情况说明传统的临床病理高危因素不能很好地确定CRC预后差和高复发风险患者。而对于手术成功的结直肠癌患者来说，Ⅰ期结直肠癌根治患者5年复发率为5%，Ⅱ期为12%，Ⅲ期则为33%［4］。研究发现，肿瘤的侵袭生长受肿瘤微环境中的肿瘤细胞和肿瘤间质的互相协同作用，基于此，肿瘤间质比（tumor stroma ratio，TSR）的概念应运而生。TSR是指肿瘤组织内肿瘤细胞和肿瘤间质的比值，最早由Mesker提出，并指出其在大肠癌中具有临床意义［5］。目前TSR已在多种上皮实体类肿瘤，如CRC、乳腺癌、胃癌、食管癌等都已有报道［6-8］，然而TSR对II、Ⅲ期CRC预后预测价值仍存在争议［9-10］，鉴于此，本文旨在探讨TSR对Ⅱ、Ⅲ期CRC患者预后评估中的指导价值。

资料与方法

一、一般资料

收集上海交通大学附属第一人民医院胃肠外科2014年1月～2018年12月期间经术后病理证实的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的临床资料、术后病理和随访结果等，并进行回顾性分析。共纳入820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，年龄24～95岁，平均年龄（65.6±12.0）岁，其中＜65岁372例，≥65岁448例；女性353例，男性467例；Ⅱ期497例，Ⅲ期323例；T1+T2期150例，T3+T4期670例；N0期495例，N1+N2共325例；神经侵犯606例，无神经侵犯214例；脉管浸润559例，无脉管浸润261例；高分化66例，中低分化754例；肿瘤直径＜5cm510例，≥5cm310例；右半结肠癌274例，左半结肠和直肠癌共546例；黏液腺癌103例，腺癌717例。

二、纳入与排除标准

1.纳入标准：（1）经活检病理组织学证实的CRC；（2）完全治愈性切除（R0切除）；（3）Ⅱ期（T3-4、N0、M0）或Ⅲ期（任何T、N1-2、M0）；（4）年龄≥18岁。

2.排除标准：（1）新辅助治疗（纤维化的形成影响肿瘤和基质的数量）；（2）CRC病史或曾罹患其他恶性肿瘤，由于长期治疗或早期原发肿瘤转移的可能影响了CRC的预后；（3）多发性结肠肿瘤，其预后相对更差，需要不同的治疗方法；（4）术后3个月内死亡的患者归因于合并症或手术并发症。

三、切片扫描方法

将新鲜手术切除标本用福尔马林固定、石蜡包埋后并将肿瘤浸润最多的组织制成5 μm厚的HE染色玻片，利用KF-PRO系列全自动数字切片扫描系统中KF-PRO-120型号数字切片扫描仪，全视野数字病理切片（whole-slide image，WSI）以KFB格式导出，利用K-Viewer浏览软件可实现图片的放大，最大可至1 600倍。共完成Ⅱ、Ⅲ期CRC患者820张HE切片的扫描。

四、TSR评估方法

WSI图片先在K-Viewer软件X10倍下找到肿瘤浸润明显的区域，确保选取区域四周都有肿瘤组织包绕，然后在X40倍镜下导出最具有侵袭性的图片，每张WSI图片从感兴趣的区域（ROI）至少导出3张图片，取平均值同时得出TSR数值。（详见图1）。当黏液坏死组织区域出现在符合我们评分标准的视野内时，黏液坏死组织区域被排除在外。两位经验丰富的病理学家对导出的图片整个肿瘤区域的TSR进行视觉评估，在没有一致结果的情况下，第三位病理学家介入并提供决定性意见。统计分析以50%作为截断值，患者根据TSR被分为“高TSR组”（TSR＞50%）和“低TSR组”（TSR≤50%）［5］。

图1 从WSI图中导出3张最具有侵袭性的区域，病理学家行视觉评估TSR

五、随访方式

所有患者均通过门诊或电话随访等方式进行随访，随访至2019年7月31日或患者死亡截止。研究过程中排除了失访病例。生存时间定义为初次手术至患者死亡或随访截止，统计患者5年总体生存率。

六、统计学方法

应用SPSS 24.0软件进行统计学分析，采用COX回归模型进行单因素和多因素分析，确定对预后有独立影响的因素；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并计算生存率，生存率比较采用Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、随访及生存情况

820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的随访资料完整，随访时间为1～68个月，中位随访时间为32个月。820例Ⅱ、Ⅲ期CRC患者中，高TSR组307例，低TSR组513例，五年总生存率为81.3%（667/820），男性和女性分别为78.9%和74.8%；＜65岁和≥65岁的五年生存率为分别为90.3%和72.9%；高分化和中低分化的五年生存率分别为95%和79.7%；Ⅱ期和Ⅲ期的五年生存率分别为78.9%和73.4%；T1+T2期和T3+T4期分别是89.7%和78.4%；N0和N1+N2分期的五年生存率分别为87.4%和69.7%；肿瘤最大径＜5 cm和≥5 cm的五年生存率分别为78.4%和80.8%；右半结肠癌和左半+直肠癌的五年生存率分别为73.9%和84%；神经侵犯和神经未侵犯的五年生存率分别为69.1%和84%；脉管浸润和脉管未浸润的五年生存率分别为68.5%和86.6%；黏液腺癌和腺癌的五年生存率分别为85.6%和80%。

二、肿瘤间质比与患者临床病理特征的相关性分析

本研究将入组患者的TSR高、低与其临床资料进行比较，发现TSR高的患者的临床指标与TSR低的患者差异均无统计学意义（均P＞0.05）。（见表1）。

表1 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者TSR与临床病理相关因素分析［例（%）］

三、间质高和间质低Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率的差异

Kaplan-Meier生存曲线分析显示，TSR低的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的5年总体生存率为83.2%（427/513），TSR高的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的5年总体生存率为76.2%（243/307）。Log-Rank检验显示，TSR低组的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率显著高于TSR高组（χ2=7.991，P=0.0047）。（见图2）。

图2 TSR高和TSR低Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率比较

四、Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率影响因素分析

单因素COX回归分析显示，年龄、TNM分期、T分期、N分期、淋巴结转移、神经侵犯、脉管浸润、肿瘤分化状态和TSR与Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的总体生存率有显著相关性（P＜0.05）；多因素COX分期显示，年龄、肿瘤位置、脉管浸润和TSR是Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率的独立危险因素（P＜0.05）。（见表2、3）。

表2 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率影响因素的单因素COX回归分析

表3 Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率影响因素的多因素COX回归分析

讨 论

肿瘤微环境包括肿瘤实质细胞、间质细胞、细胞外基质和细胞分泌的细胞因子等，其在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要作用。肿瘤微环境在肿瘤行为中起着积极的作用，通过与肿瘤细胞相互作用影响肿瘤的进展和肿瘤的转移能力，研究认为TSR可能反应了这种相互作用。鉴于现有对TSR的研究，CRC不应只根据肿瘤细胞特征进行分类，还应根据肿瘤微环境特征进行分类，目前已经有学者证实TSR与CRC患者的预后相关，并且可作为独立的预后因素，高TSR组的CRC患者预后不良。TSR是CRC强有力的独立预后工具，为目前临床使用的TNM分类提供了额外的价值。

目前根据国际TNM病理分期标准，同一期的不同患者预后有很大差异，有的Ⅱ期CRC的患者预后比Ⅲ期CRC患者预后差，表明现有的TNM分期不能很好的发现某些潜在的“高危”患者［11］。此外针对CRC的治疗，很多需要手术治疗后进行辅助放化疗，预防肿瘤复发和转移，而辅助治疗的方案和时间取决于TNM分期，而目前的TNM分期也不能完全精准的预测CRC患者对辅助放化疗的敏感性。基于此，我们从肿瘤微环境出发，在病理学水平寻找更有临床价值的高危因素。大量研究表明原发性肿瘤中TSR是一个很有潜在价值的肿瘤预后因素［12-13］，TSR高的患者预后更差。

我们回顾了上海交通大学附属第一人民医院的2014年至2018年的Ⅱ、Ⅲ期CRC患者，在肿瘤浸润前沿的常规苏木精和伊红染色石蜡切片上评估TSR。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，TSR低组Ⅱ、Ⅲ期的5年总体生存率为83.2%（427/513），TSR高组Ⅱ、Ⅲ期的5年总体生存率为76.2%（243/307），Log-Rank检验显示，TSR低组总体生存率显著高于TSR高组（χ2=7.991、P=0.0047）。我们研究证明了TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC的预后意义。目前由于TSR识别的简单性和可靠性，在当前的常规病理学诊断中，TSR的实施医疗负担较轻，且成本较低。

目前针对II、Ⅲ期CRC患者，指南建议可以辅助卡培他滨单药或者卡培他滨联合奥沙利铂治疗，这种组合已显示出显著改善无病生存率和总生存率的极大价值［14］。目前国内外指南均认为辅助化疗中增加奥沙利铂只能使高危复发风险Ⅱ期患者受益，因此我们需要寻找Ⅱ期CRC中高危亚群患者。NCCN指南推荐［15］在高危Ⅱ期肠癌中应用含奥沙利铂的辅助化疗方案，对于不含高危因素的中危和低危Ⅱ期肠癌患者，推荐观察或单药卡培他滨治疗。对于Ⅲ期CRC辅助化疗是主要及绝对适应证，也是目前CRC辅助化疗的主要受益人群。NCCN指南认为所有Ⅲ期结肠癌患者都需要辅助化疗。2018年的NCCN指南基于IDEA研究结果［16］指出：（1）低危Ⅲ期CRC患者辅助化疗首选包括CAPOX 3个月或FOLFOX 3～6个月；（2）高危Ⅲ期CRC患者辅助化疗首选包括CAPOX 3～6个月或FOLFOX 6个月，对于Ⅲ期患者如何区分高危和低危，IDEA研究指出这种根据TNM分期进行危险分层方法具有很大的局限性。基于我们的研究表明TSR可以作为Ⅱ、Ⅲ期CRC患者预后独立的因素，可以为将来的Ⅱ、Ⅲ期CRC进行高危因素亚组分组，推荐TSR高的Ⅱ期CRC进行卡培他滨联合奥沙利铂辅助化疗方案，推荐TSR高的Ⅲ期CRC进行6个月辅助化疗，这将为Ⅱ、Ⅲ期CRC患者的辅助化疗提供精准方案。

有学者研究表明［17］，TSR高组的Ⅱ期CRC辅助化疗可明显改善患者预后，TSR低组的Ⅲ期CRC通常不需要辅助化疗。也有学者研究探索性分析表明［18］，在以奥沙利铂为基础的静脉化疗中加入贝伐单抗后，TSR低组的肿瘤的DFS和OS显著缩短，而TSR高组的肿瘤则相反，在TSR高组的肿瘤中观察到了有益的趋势。这些研究表明，TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC乃至其他恶性肿瘤中具有重要预后价值［13］。我们的多因素COX分期研究结果表明，年龄、肿瘤位置、脉管浸润和TSR是Ⅱ、Ⅲ期CRC患者总体生存率的独立危险因素（P＜0.05），这和国外学者［11］报道具有一致性。

我们的研究对TSR在Ⅱ、Ⅲ期CRC中预后判断得出了初步的结论，TSR高组的Ⅱ、Ⅲ期CRC的预后明显比TSR低组的CRC患者预后差，TSR可以作为Ⅱ、Ⅲ期CRC评估患者独立预后的指标。TSR有望为CRC的TNM分期提供有力补充，并为Ⅱ、Ⅲ期CRC患者辅助放化疗提供精准的方案。