血浆外泌体HSP90α对预测结直肠癌肝转移的价值探索

周嘉慧 陈思彤 刘海洲 韦文娥 张力图

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率位于所有恶性肿瘤的第3位，死亡率则居于第2位，是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一［1］，其中肝转移的发生率高，预后差。因此，在结直肠癌肝转移的早期诊断十分重要［2］。目前，在肿瘤诊断中，肿瘤标志物的应用已获得共同认可［3］。热休克蛋白90α（HSP90α）是热休克蛋白家族中的重要成员，和肿瘤有着密切关系［4］，近年来被发现，其在结直肠癌临床诊断上也具有重要指导意义［5］。最近，外泌体已成为研究肿瘤发生、发展、侵袭、转移和治疗的明星结构［6］。它是一种直径约为40 nm～100 nm的微小膜泡，被膜结构可以保护其内含物（DNA，RNA和蛋白质等多种物质）不受膜外的微环境中其他因子的影响从而处于较稳定的状态［7-8］。有研究证实血浆游离HSP90α可以从受损或死亡的细胞被动释放，而外泌体HSP90α可以从细胞中主动释放出来［9］，在肿瘤发展的过程中起促进肿瘤细胞迁移的作用［10］。目前，关于HSP90α在结直肠癌患者血浆外泌体中的表达及其临床诊断价值尚无报道。本研究拟应用超速离心法提取I～III期原发性结直肠癌患者和结直肠癌肝转移患者的血浆外泌体，并应用ELISA法检测其HSP90α表达，与相同患者血浆游离HSP90α比较。探讨结直肠癌患者的血浆外泌体HSP90α是否能作为肝转移标志物。

对象与方法

一、研究对象

随机选取2017年11月至2020年4月于广西医科大学附属肿瘤医院收诊的初治结直肠癌患者共54例，所有患者均具有完整的临床和病理资料，采血前均未经过放疗、化疗等治疗，均未合并其他肿瘤和免疫系统疾病。患者术后分期按照AJCC第8版TNM分期标准［11］进行，其中原发性结直肠癌（pCRC）27例，男性12例，女性15例，年龄为36～86岁，平均（60.33±12.98）岁。结直肠癌肝转移（CRLM）27例，男性20例，女性7例，年龄为36～76岁，平均（60.41±11.74）岁。本研究获得本院伦理委员会批准，所有患者均自愿签署知情同意书。

二、实验方法

1.标本的采集：所有受检者清晨空腹采集静脉全血5 mL于EDTA-k2抗凝管内，在室温3 000 r/min离心15 min，吸取上层血浆用于游离HSP90α检测和外泌体提取及检测。

2.血浆外泌体的提取与鉴定：我们利用超速离心法对外泌体进行分离，分离方法如下：取血浆样本1 mL于离心管中，加入等体积PBS缓冲液稀释。25℃条件下500×g离心10 min，取上清液，25℃条件下2 000×g离心10 min，小心吸取上清液，25℃条件下10 000×g离心30 min，转移上清液于超高速离心专用离心管中，精确配平各离心管中的液体，4℃条件下100 000×g离心180 min，丢弃上清，所得沉淀即为外泌体，PBS重悬，-80℃冻存。

我们根据国际细胞外囊泡学会（ISEV）的指导性文件［12］，从外泌体形态，粒径大小和蛋白质分子标记这三方面验证所得外泌体。我们对提取的所有血浆外泌体样本应用纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）鉴定外泌体的粒径大小，随机抽选两例依次应用透射电子显微镜（TEM）鉴定外泌体的形态，免疫印迹实验（Western blot）检测外泌体表面标志物蛋白（CD9，TSG101）的表达情况。具体操作步骤照说明书进行。

3.HSP90α的检测：采用HSP90α酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（烟台Protgen生物技术开发有限公司，中国烟台）测定血浆游离HSP90α和外泌体HSP90α的水平。

三、统计学方法

本研究中所有定量数据均以中位数（极小值～极大值）表示。采用SPSS 17.0统计学软件进行数据统计分析。各组间血浆游离HSP90α和血浆外泌体HSP90α表达水平的比较均使用非参数检验。影响因素的分析采用两分类Logistic回归模型。绘制ROC曲线。最佳截止值是通过使用与Youden指数最大值相对应的量来确定的（Youden指数=敏感性+特异性-1）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、超速离心法提取的血浆外泌体符合外泌体标准

利用TEM观察外泌体的形态及大小，结果显示外泌体呈类圆形、茶托样囊泡结构，可见完整包膜，见图1A。应用Western blot对标记蛋白进行检测，结果显示两份样品均表达CD9，TSG101，见图1B。利用NTA对血浆外泌体的大小、浓度和分布进行分析，结果显示外泌体平均粒径大小为109.8 nm，浓度为1.8×1010个/mL，见图1C。

图1 外泌体的鉴定。1A：外泌体在电镜下的表现形态（100 nm大小比例尺）；1B外泌体表面标记蛋白；1C：ZETAVIEW分析外泌体粒径

二、血浆游离HSP90α和血浆外泌体HSP90α表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系

不同性别，分化程度，CEA表达水平与CRC患者血浆外泌体HSP90α和血浆游离HSP90α表达水平差异均无统计学意义（P＞0.05），不同肿瘤部位血浆外泌体HSP90α差异有统计学意义（H=6.426，P＜0.05），其中右半结肠组表达水平最高。Ⅳ期CRLM患者血浆游离HSP90α和外泌体HSP90α表达水平明显高于Ⅰ～Ⅲ期，差异均有统计学意义（Z=3.036，2.898；P＜0.05）。结果见表1。

表1 结直肠癌患者血浆游离HSP90α和血浆外泌体HSP90α表达水平与临床病理特征的关系

三、血浆外泌体HSP90α与其他临床指标在结直肠癌肝转移诊断中的比较

将血浆外泌体HSP90α、血浆游离HSP90α、CEA作为自变量，原发结直肠癌和结直肠癌肝转移作为因变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示：血浆外泌体HSP90α、血浆游离HSP90α、CEA是诊断结直肠癌肝转移的危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 结直肠癌肝转移风险因素的Logistic回归分析

单项指标的诊断效能分析显示，CEA、血浆游离HSP90α、血浆外泌体HSP90α、均展现出了一定的诊断价值，血浆外泌体HSP90α结合CEA具有最高的诊断效能（AUC=0.861）。见表3。

表3 各指标及联合诊断对结直肠癌肝转移诊断的ROC曲线分析结果

讨 论

据报道结直肠癌肝转移患者在未经治疗时的5年生存率低于5%，中位生存时间少于12个月，而早期完全切除肝转移病灶后生存率可以增长至30%～50%，中位生存期可以延长至35个月［13］。因此，对结直肠癌肝转移患者进行早期诊断对提高患者生存率及改善预后来说十分重要。HSP90α是一种细胞内伴侣蛋白，越来越多的证据表明，HSP90α的高表达与恶性肿瘤的发生有关，如肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、食道癌、胰腺癌和淋巴瘤［14-16］。

外泌体分离和提取的方法有多种，超速离心法和试剂盒法是目前外泌体分离最常用的技术［17］，最优分离方法尚无定论。超速离心法被认为是金标准，但所需设备大，价格昂贵，且提取时间较长，在高效性方面有一定的不足。本研究使用超速离心法提取血浆外泌体，并检测HSP90α在结直肠癌患者中的表达情况。我们发现血浆外泌体HSP90α在Ⅳ期肝转移患者的表达水平明显比Ⅰ～Ⅲ期更高（P＜0.05）。这说明血浆外泌体HSP90α可用于诊断结直肠癌肝转移。由此可知，超离法虽然会造成外泌体的一定损失，但获得纯度较高的外泌体，在血浆外泌体HSP90α用于诊断结直肠癌肝转移中具有较高的应用价值。

本研究进一步分析了结直肠癌肝转移患者血浆外泌体HSP90α的表达水平与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤部位及CEA表达水平等临床病理特征之间的关系，发现血浆外泌体HSP90α水平与年龄和肿瘤部位有关。采用最佳截断值，血浆外泌体HSP90α表达水平对结直肠癌肝转移的诊断具有较高的敏感性和特异性。

目前单一蛋白作为生物标记物的敏感性和特异性都受到限制，因此，和其他研究［19-20］一样，我们将CEA和我们目前研究的标志物结合起来，以期达到更高的敏感度和特异度。从结果看，血浆外泌体HSP90α联合CEA诊断结直肠癌肝转移的AUC为0.861，敏感度为66.67%，特异度为92.59%。对照相同患者血浆游离HSP90α联合CEA诊断结直肠癌肝转移的AUC为0.830，敏感度为62.96%，特异度为96.3%，上述结果表明血浆外泌体HSP90α与CEA联合检测能够进一步提高结直肠癌肝转移的临床检出率。血浆外泌体HSP90α可以作为结直肠癌肝转移的潜在新型肿瘤标志物。

本研究还存在一定的不足，首先纳入样本数量较少，造成结果存在一定误差。其次外泌体提取方法当中超离法过于繁杂，其对临床诊断的贡献略显不足，HSP90α检测前外泌体提取方法的优化是我们进一步研究的内容。并且我们的结果显示单独的血浆HSP90α诊断效能高于血浆外泌体HSP90α，后期我们会利用更精准的方法并且优化试剂盒的使用范围以求更简便的提取血浆外泌体HSP90α。

综上所述，本研究证实了血浆外泌体HSP90α可以作为诊断结直肠癌肝转移的传统标志物的有效补充。