响应面法优化巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的培养条件

陈 辉，赵丹霞，林敦尖，冉继伟，刘 辉*

（广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300）

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一种重要的淀粉脱支酶，已经被广泛应用到水解支链淀粉，糖原和其他含有α-1,6糖苷键的支链多糖中[1]。普鲁兰酶根据底物特异性和水解产物的不同可以分为五大类：（i）I型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）；（ii）II型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41），除了水解普鲁兰糖中的α-1,6糖苷键，还能水解淀粉中的α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键；（iii）新普鲁兰酶（EC 3.2.1.135）；（iv）异普鲁兰酶（EC 3.2.1.57）；（v）普鲁兰糖水解酶III型（EC 3.2.1-）[2-3]。

普鲁兰酶在工业生产中有着广泛的应用。到目前为止，报道的产普鲁兰酶的微生物种类繁多，主要为芽孢杆菌属，如Bacillus cereus，Bacillus subtilis和Paenibacillus，其普鲁兰酶酶活经过优化后分别达到1.18 U/mL，1.36 U/mL和11.1 U/mL[4-6]。关于巨大芽孢杆菌产野生普鲁兰酶的报道较少，有报道在大肠杆菌中成功克隆表达了巨大芽孢杆菌中的普鲁兰酶基因[7]。目前已发现的普鲁兰酶大多数是酸性普鲁兰酶，碱性普鲁兰酶却鲜有报道，碱性普鲁兰酶添加到洗涤剂中可以极大提高洗涤效果，特别是针对淀粉类污渍[8]。现已报道的产碱性普鲁兰酶的微生物有AlkalophilicBacillussp.S-1，AlkalophilicBacillussp.KSM-1876，Pseudoalteromonassp.M25[9-11]。

已有研究表明，普鲁兰酶与淀粉酶一起作用，可以高效协同的完全水解淀粉得到麦芽三糖和麦芽四糖[12]，有研究报道关于产麦芽六糖的α-淀粉酶[13-14]，未见有报道关于产麦芽六糖的普鲁兰酶。本研究在云南省昆明市玉米秸秆腐殖质土壤中筛选分离鉴定得到一株产碱性普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），该普鲁兰酶可作用于普鲁兰糖得到麦芽六糖。本研究通过单因素和响应面优化试验对巨大芽孢杆菌培养基成分和发酵条件进行优化，以期得到产普鲁兰酶最佳培养条件，为普鲁兰酶的开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103：从云南省昆明市玉米秸秆腐殖质土壤中筛选分离得到；蛋白胨、酵母膏、无机盐等：北京奥博星生物技术有限公司；普鲁兰糖：日本林原公司；糯米淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、硫酸铵、醋酸铵、葡萄糖等（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；蛋白质标准Markers：日本TAKARA公司；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒（Qiagen）、Qiagen凝胶回收试剂盒、DNA标准Markers、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂、巨大芽孢杆菌16S rDNA通用引物（27f：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1495r：5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3'）：上海生工生物工程有限公司；麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽六糖、异麦芽六糖：美国Miragen公司；薄层层析（thin layer chromatography，TLC）硅胶板：德国Merck公司。

富集培养基：糯米淀粉10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH自然；

鉴别培养基：普鲁兰糖3.0 g/L，琼脂15.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH自然；

发酵培养基与种子培养基：糯米淀粉5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 2.0 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH自然。

初始发酵都发生于装有50 mL培养基的250 mL三角锥形瓶中，25 ℃、180 r/min摇瓶培养，PCR反应条件为95 ℃变性4 min，然后95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2 仪器与设备

TS-200电热恒温培养箱：上海天城实验仪器制造有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：FD50R高压蒸汽灭菌锅、XMTD-204数显恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-2450S（E）紫外分光光度计：日本岛津公司；XR1台式高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；FE20 pH计、AL204电子分析天平、DYY-6C琼脂糖凝胶电泳仪、T100梯度PCR仪：北京六一科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 巨大芽孢杆菌Y103发酵单因素试验

安康市位于陕西省东南部，属国务院公布的全国14个连片特困地区之一——秦巴山区核心地带，脱贫攻坚任务十分艰巨［1］；呈贫困体量大、贫困程度深、脱贫难度大特点。为实现2020年脱贫的目标，安康市各级政府统筹部署，攻坚克难，目前已经取得了显著的成效：贫困人口数量逐步减少，贫困农村落后的基础设施得到改善，贫困农民的生活水平有了明显提高和改善。然而，课题组成员2016—2018年在安康市多个贫困村调查时发现，当地农村还存在一个棘手难题，即已达婚龄的男青年婚恋越来越困难，具体表现在三个方面：一是可婚配的女青年少；二是婚姻支付昂贵；三是婚姻极不稳定。

在发酵培养基的基础上，分别考察了以下因素对巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的影响。碳源种类（普鲁兰糖、糯米淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉和葡萄糖）及碳源添加量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L），氮源种类（酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、醋酸铵、酵母膏＋蛋白胨（1∶1）、酵母膏＋蛋白胨（1∶2）、酵母膏＋蛋白胨（2∶1））及氮源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L），培养基初始pH（7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5），发酵温度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h），接种量（1%、2%、3%、4%、5%）。根据单因素试验结果和实际情况，挑选出影响产酶的显著性因素进行响应面设计。

1.3.2 巨大芽孢杆菌Y103发酵响应面设计试验

在单因素试验的基础上，选择4个对产普鲁兰酶影响著性的因素：发酵温度（A），初始pH（B），发酵时间（C），碳源添加量（D）为自变量，以普鲁兰酶酶活（Y）为因变量。利用Design-Expert.V.8.0.6.1.软件进行4因素3水平的响应面试验设计。响应面试验因素与水平编码见表1。

表1 巨大芽孢杆菌Y103发酵条件优化Box-Behnken试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization of Bacillus megaterium Y103

1.3.3 普鲁兰酶蛋白纯度及相对分子质量的测定

酶蛋白纯度及相对分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，参照LAEMMLI U K等[16]的方法进行试验，采用120 g/L分离胶和50 g/L浓缩胶进行凝胶电泳。蛋白条带用考马斯亮蓝R250染色后脱色，蛋白质标准Markers作为标准品。

酶谱试验：参照PAN D等[17]的方法有所修改，分离胶中添加1%的普鲁兰糖作为底物。

1.3.4 粗酶液酶学性质的研究

最适pH与最适温度：将发酵液离心后的上清液作为粗酶液，在50 ℃、pH 5～10的条件下测定酶活。将最高酶活定义为100%，分别计算不同pH下的相对酶活。在pH 8.0、35～60 ℃的条件下测定酶活。将最高酶活定义为100%，分别计算不同温度下的相对酶活。

1.3.5 水解产物单糖组成分析

参照LIU X等[18]的方法进行薄层层析试验，定性分析粗酶液水解普鲁兰糖的水解产物，接着通过高效阴离子交换色谱（high performance anion exchange chromatography，HPAEC）定量分析粗酶液水解普鲁兰糖的产物，用流动相A（250 mmol/L氢氧化钠溶液）和B（1 mol/L氢氧化钠三水合物在250 mmol/L氢氧化钠溶液中）进行梯度洗脱，用麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽六糖和异麦芽六糖作为标准品。

1.3.6 测定方法

普鲁兰酶酶活的测定：参考ROY A等[15]的方法进行实验。酶活单位定义：一个普鲁兰酶酶活单位定义为在上述测定条件下从普鲁兰糖中每分钟释放1 μmolD-葡萄糖还原糖当量的酶量，以1 U/mL来表示。

1.3.7 数据处理与分析

所有试验数据取3 次重复试验的平均值，并计算标准误差。用Origin 8.5进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和最小显著性差异分析（least significant difference，LSD），并用该软件进行作图。响应面试验设计通过Design-Expert 8.0.6.1软件进行分析与处理，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 巨大芽孢杆菌Y103发酵单因素试验结果

图1 碳源种类（A）、碳源添加量（B）、氮源种类（C）、氮源添加量（D）、发酵温度（E）、培养基初始pH（F）、发酵时间（G）、接种量（H）对巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的影响Fig.1 Effect of carbon source (A),carbon source addition (B),nitrogen source (C),nitrogen source addition (D),fermentation temperature (E),initial pH of medium (F),fermentation time (G) and inoculum (H) on pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

由图1A可知，用糯米淀粉作为碳源时普鲁兰酶的酶活最高，为0.06 U/mL，巨大芽孢杆菌Y103不能利用葡萄糖产普鲁兰酶，可能是因为葡萄糖中没有α-1,6糖苷键，不能够诱导该菌株产生普鲁兰酶，选择糯米淀粉作为培养基的碳源。由图1B可知，随着糯米淀粉添加量的增加，普鲁兰酶的酶活也随之提高，当糯米淀粉的添加量为10 g/L时，普鲁兰酶酶活最高，为0.09 U/mL，当添加量超过10 g/L时，普鲁兰酶酶活反而降低，可能是因为糯米淀粉添加量较高时培养基比较黏稠，降低了培养基中的溶解氧含量。由图1C可知，复合氮源优于单一氮源，且有机氮源优于无机氮源，当使用复合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）时，普鲁兰酶酶活最高，为0.11 U/mL。由图1D可知，随着复合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）添加量的增加，普鲁兰酶的酶活也随之提高，当复合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶2）添加量为40 g/L时，得到普鲁兰酶酶活最高，为0.21 U/mL，当氮源添加量超过40 g/L时反而降低，可能是由于过多的氮源诱导菌株产生蛋白酶将目标蛋白分解。由图1E可知，随着发酵温度的不断升高，普鲁兰酶的酶活呈现先上升后下降的趋势，当发酵温度为20 ℃时，普鲁兰酶酶活最高，为0.41 U/mL，随着温度继续升高酶活降低，可能因为温度过高影响了该菌株的生长，有研究证明微生物产普鲁兰酶偏向一个较低的温度，产酶温度通常低于其最佳生长温度[6，22]。由图1F可知，随着培养基初始pH由酸性向碱性变化时，普鲁兰酶酶活先上升后下降，培养基初始pH在8.5时普鲁兰酶产量最高，类似地，菌株Exiguobacteriumsp.SH3[3]，Bacillus acidopullulyticus[23]和Clostridium thermosulfurogenesSV2[24]产碱性普鲁兰酶也更喜欢一个偏碱性的培养基（pH 7.5～8.5）。由图1G可知，该菌株产酶随发酵时间延长呈先上升后下降的趋势，在60 h时普鲁兰酶酶活最高，达到0.69 U/mL，随后酶活开始降低，可能由于此时巨大芽孢杆菌的一些次级代谢产物如蛋白酶影响了普鲁兰酶的活性，而且在发酵过程中可能存在反馈抑制调节[4]。由图1H可知，接种量对产酶没有显著影响接种量在2%时酶活最高，达到0.71 U/mL。

2.3 巨大芽孢杆菌Y103响应面试验优化结果

响应面试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。对表2的数据进行二次多项回归拟合，得到普鲁兰酶酶活（Y）对发酵温度（A），培养基初始pH（B），发酵时间（C）和碳源添加量（D）的二次回归多项式方程：

Y=0.76+0.096A+0.073B-0.038C-0.023D+0.100AB+0.028AC-0.020AD-0.045BC+7.500E-003BD-0.033CD-0.25A2-0.16B2-0.087C2-0.032D2

表2 巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶条件优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

表3 响应面二次模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model

续表

由表3可知，回归模型（P＜0.01），表明方程模型极显著，失拟项值（P=0.126 7＞0.05），失拟项不显著。一般来说，回归模型的总决定系数R2高于90%，就认为有较高的可信度。该回归模型的总决定系数R2=0.986 1，调整决定系数R2adj=0.972 1，预测决定系数R2pre=0.925 9，说明该模型可信度高，拟合程度较好，试验误差小[25]，因此该回归方程模型成立，能够准确分析普鲁兰酶产量与4个因素之间的关系及其交互作用的影响。回归模型的一次项A、B、C，交互项AB、BC与二次项A2、B2、C2对酶活影响极显著（P＜0.01），一次项D，交互项CD与二次项D2对酶活影响显著（P＜0.05），其他项对酶活影响不显著（P＞0.05）。

响应面分析及交互作用对普鲁兰酶酶活的影响如图2所示。由图2a可知，当温度较低时普鲁兰酶的酶活也较低，随着温度升高，普鲁兰酶的酶活也显著提高，表明温度有显著性影响，随着温度的升高，在培养基初始pH值为8.5时有最大的响应值，且沿着pH轴的不同水平下响应值也有显著性变化，表明发酵温度和培养基初始pH对普鲁兰酶的酶活存在相当大的交互作用，这与B.halodurans产普鲁兰酶优化时的结果类似[21]。由图2b可知，培养基初始pH与发酵时间对普鲁兰酶的酶活也有极大的交互作用，在发酵时间持续到60 h时，随着培养基初始pH的从7.5增加至8.5，普鲁兰酶的酶活从0.36 U/mL增加至0.60 U/mL，随着培养基初始pH从8.5增加至9.5，普鲁兰酶的酶活从0.60 U/mL下降至0.53 U/mL。由图2c可知，随着发酵时间持续到60 h，当碳源添加量从0.5%增加至1%，普鲁兰酶酶活从0.38 U/mL增加至0.73 U/mL，超出这个时间和添加量范围后酶活缓慢降低。

根据响应面软件分析结果得到巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶的最佳培养基配方为糯米淀粉8.5 g/L，酵母膏13.3 g/L，蛋白胨26.7 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，NaCl 2.0 g/L。最佳的发酵条件为：培养基初始pH8.8，发酵温度21 ℃，发酵时间55 h。在最佳工艺条件下进行3次验证试验，得到普鲁兰酶酶活平均值为0.77 U/mL，与理论值（0.78 U/mL）接近，验证了该模型的准确性和有效性。是优化前（0.24±0.02）U/mL的3.21倍。

图2 发酵温度、培养基初始pH、发酵时间交互作用对巨大芽孢杆菌Y103产普鲁兰酶酶活影响的响应曲面与等高线Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,initial pH of medium and fermentation time on pullulanase production by Bacillus megaterium Y103

2.4 普鲁兰酶蛋白纯度及相对分子质量的测定

图3 普鲁兰酶的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.3 Results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of pullulanase

由图3可知，得到3条普鲁兰酶蛋白条带和1条淀粉酶蛋白条带。从SDS-PAGE估算得到2条普鲁兰酶蛋白质条带的分子质量为102.5 kDa和79.1 kDa，与美国国家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中Genbank里面巨大芽孢杆菌两个普鲁兰酶基因的预测普鲁兰酶大小相一致，表明两条带均是普鲁兰酶条带[26]。

2.5 普鲁兰酶的部分酶学性质

图4 普鲁兰酶粗酶液最适pHFig.4 Optimal pH of crude pullulanase solution

图5 普鲁兰酶粗酶液最适温度Fig.5 Optimal temperature of crude pullulanase solution

由图4、图5可知，普鲁兰酶粗酶液的最适作用pH为8.0，最适作用温度为50 ℃，表明该普鲁兰酶是一种碱性的耐热性普鲁兰酶。有报道称B.halodurans，alkalophilicBacillussp.S-l和Bacillussp.KSM-1876几种芽孢杆菌产碱性普鲁兰酶的最适作用pH为8.0～10.0，最适作用温度是50 ℃[21，27]。

2.6 水解产物单糖组成分析

根据1.3.5的方法，普鲁兰酶水解普鲁兰糖后得到的产物有麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽六糖和异麦芽六糖，表明其既能水解α-1,6糖苷键，又能水解α-1,4糖苷键，推测该巨大芽孢杆菌Y103所产的普鲁兰酶为一种新颖的II型普鲁兰酶。由表4可知，普鲁兰酶水解普鲁兰糖后产物分别为麦芽三糖13.616 μg/mL，麦芽四糖1.882 μg/mL，麦芽六糖14.660 μg/mL，异麦芽六糖1.185 μg/mL。现有许多研究报道了产麦芽六糖的淀粉酶[14-15]，而关于产麦芽六糖的普鲁兰酶却很少见报道。由此可见，本研究得到的普鲁兰酶在麦芽六糖的生产中有着潜在的巨大利用价值。

表4 水解普鲁兰糖的单糖组成分析Table 4 Analysis of monosaccharide composition of pullulan hydrolytic products

3 结论

本研究从云南省昆明市玉米秸秆腐殖质土壤中成功筛选鉴定出一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌Y103，通过单因素试验和响应面优化试验成功对其产普鲁兰酶条件进行优化，得到最佳培养基配方为糯米淀粉8.5 g/L，酵母膏13.3 g/L，蛋白胨26.7 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，NaCl 2.0 g/L；最佳发酵条件为初始pH8.8，发酵温度21 ℃，发酵时间55 h。此条件下普鲁兰酶酶活从优化前的（0.24±0.02）U/mL提高至（0.77±0.03）U/mL，是之前的3.21倍，优化效果明显。该新颖的II型普鲁兰酶是一种碱性热稳定性普鲁兰酶，可以是洗涤剂中的有效添加剂，其水解普鲁兰糖的水解产物有大量的麦芽三糖和麦芽六糖，在高麦芽糖浆和麦芽六糖的生产中有着潜在的巨大利用价值。不足之处本研究在实验室摇瓶条件下进行，要实现工业化大规模开发生产，还需要进一步发酵工艺的研究。