基因组拷贝数变异测序与染色体核型分析在胎儿遗传学诊断中的比较*

杨黎明，张华，袁路，张富青，郭华峰

（郑州市妇幼保健院生殖遗传科，河南郑州 450000）

我国每年新增出生缺陷人口数约为80～120万，据文献报道，约20%的出生缺陷患儿是由染色体畸变引起的［1］。因此，产前遗传学检测至关重要。随着高通量测序技术的迅猛发展，极大地推动了分子技术在临床产前筛查、遗传病检测、肿瘤检测、微生物病原体检测及器官移植排斥筛查等方面的应用［2］。2019 年4 月，《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》指出，基因组拷贝数变异测序（copy number variation sequencing,CNV-seq）技术可以弥补染色体核型分析的不足，对于染色体病高风险胎儿，CNV-seq 技术可作为一线产前诊断方法［3］。而染色体核型分析作为细胞遗传学诊断的“金标准”，广泛应用于临床。本研究通过比较两种方法在产前胎儿遗传学诊断中的检出效率，来讨论其应用价值，特别是在性染色体异常方面的应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年9 月至2020 年7 月于郑州市妇幼保健院有产前诊断指征，其接受侵入性产前诊断的孕妇259 例，在18～24 周进行羊水穿刺，对标本进行染色体核型分析和CNV-seq。本研究侵入性产前诊断取材，送检检测方法均遵守郑州市妇幼保健院医学伦理学委员会的要求，所有孕妇均进行产前遗传咨询，并被充分告知相关产前遗传学诊断的必要性、局限性及风险，经患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 研究方法

在B 超引导下进行羊水穿刺，染色体核型分析由本院细胞遗传实验室完成。取材后进行羊水细胞培养、收获、制片及G 显带核型分析。使用莱卡120 全自动分析系统，显微镜下观察计数20个分裂像，分析5 个核型，发现异常，加大计数至50～100 个细胞；CNV-seq 外送至郑州大学第一附属医院产前诊断中心，使用Illumina NextSeq CN500 高通量测序仪（中国），二代测序法检测。染色体核型分析根据人类细胞遗传学国际命名体系（ISCN 2016）进行命名，CNV 致病性判读根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）诊断标准进行。

2 结果

2.1 CNV-seq 结果

259 例标本中，共检出染色体拷贝数异常22例，检出率为8.49%，染色体异常和致病性的微缺失、微重复16 例，占6.18%；其中三体12 例，分别为：21 三体7 例，18 三体2 例，性染色体异常3 例（2 例克氏综合征和1 例超雌综合征）；染色体微缺失微重复9 例，其片段大小均小于10 Mb，其中2 例结果判断为良性，3 例结果判断为临床意义未明，3 例致病，1 例为携带者。Xp22.31 缺失3 例，占微缺失微重复总数的1/3，性染色体嵌合1 例；三倍体1 例。见表1。

表1 两种检测方法检测染色体异常的结果比较

续表1

2.2 染色体核型分析结果

259 例标本中，染色体核型分析结果显示，共有17 例染色体异常，检出率为6.56%。其中三体12 例，10 例与CNV-seq 结果完全一致，另2 例核型分析诊断为罗氏易位导致的21 三体，CNV 仅提示为21 三体；结构异常3 例，即罗氏易位2 例，4 号染色体臂间倒位1 例。三倍体1 例，与CNV-seq结果一致；1 例性染色体嵌合核型。见表1。

此外，还检出染色体多态7 例，占3.20%。分别是1qh+2 例、21pstk+2 例、22ps+1 例、inv(9)(p12q13)1 例、inv(1)(p13q21)1 例。

3 讨论

染色体核型分析是细胞遗传学产前诊断的“金标准”，但该技术细胞培养时间长、分辨率低，无法诊断亚显微水平的拷贝数变异。CNV-seq 是一项基于高通量测序技术的基因组拷贝数变异检测，与核型分析、染色体微阵列分析等其他技术相比，不仅可以检测染色体微阵列分析（CMA）芯片平台所覆盖的染色体疾病类型，还可发现芯片探针未覆盖区域染色体的微缺失、微重复，且具有成本较低，重复性好，所需DNA 样本量低等优点［4］。很多研究对该方法的适用性进行评估，报道该技术相较于核型分析，对致病性或可能致病性有更高的检出率，有很好的可靠性和准确性［4-5］。

本研究中，CNV-seq 与染色体核型分析对于染色体非整倍体检测效力是一致的，一致率为100%。但无法检出相互易位和倒位的染色体结构重排。本研究中，核型分析发现2 例易位型21 三体综合征，而CNV-seq 虽然能检出该类型21 三体，却不能判断其具体结构类型，因此，不能给予此类不良妊娠史妇女提供有正确的生育指导。这是由于CNV-seq 自身的技术原理所局限的，CNV-seq 是对样本DNA 进行低深度全基因组测序，将测序结果与人类参考基因组碱基序列进行对比，通过生物信息分析发现样本存在的拷贝数变异，主要是对DNA 量化判断染色体的缺失和重复，因此，它对染色体的非整倍体以及微缺失和微重复的检测效率较高。本研究中，通过CNV-seq 联合STR 方法检出三倍体1 例：69，XXX；随后核型分析结果进行了确诊。因此，染色体核型分析和CNV-seq 可以相互补充，核型也不能被取代。

其中，通过CNV-seq 检测出3 例Xp22.31 缺失（1.68 Mb），缺失位置完全一致，包括2 例男性胎儿和1 例女性胎儿，且这三例孕妇皆是因为鱼鳞病以外的临床指征进行羊水穿刺进行CNV-seq检测，占致病性微缺失、微重复的33.3%，可见其发病率之高。Xp22.31 杂合缺失片段包含5 个OMIM 基因，均含有XLI 的STS 主效基因，STS 与鱼鳞病相关，呈 X 连锁隐性遗传OMIM［300747］。该缺失片段完全覆盖类固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase,STS）缺乏症所在区域（X：6455812-8133195），判断Xp22.31 缺失（含STS）为致病性CNV。其主要临床表现为皮肤鱼鳞状改变，以X 连锁隐性方式遗传，男性多为患者，女性多为表型正常的携带者［6］。白周现等［6］的研究报道新的单中心XLI 相关Xp22.31 片段缺失的人群频率（1.66‰）和相同位置的Xp22.31 片段重复的人群频率（4.42‰）。其研究认为CNV-seq 检测技术可应用于缺失型XLI 的基因诊断及产前诊断，并且该技术能够同时对全基因组范围内的拷贝数异常进行筛查。由此可见，CNV 检测是很有必要的。

在本研究中有1 例无创提示性染色体非整倍体异常的病例进行产前诊断，其染色体核型分析的结果和CNV-seq 的结果不完全一致，CNV-seq的结果提示为胎儿Yp11.2q11.221 存在约13.16 Mb嵌合重复，异常嵌合比例约50%；Yq11.222q11.23存在约8.0 Mb 缺失。而染色体核型的结果为45，X[46]/46,X,del(Y)(q11.2)[20]，考虑为特纳综合征，饶慧华等［7］报道的胎儿CMA 中也有1 例类似报道，由此可见，对于怀疑性染色体异常时，需结合核型分析和CNV 的检测结果以及胎儿的超声检查结果，综合分析，甚至可以进一步行脐血染色体检查或者采用荧光原位杂交技术进行验证。有研究也认为［8］，对于染色体嵌合体不应急于终止妊娠，需采用多种方法加以验证，并需要对胎儿形态进行细致的超声评估，从而更加准确地确定嵌合类型以及异常核型的嵌合比例，为临床医师指导遗传咨询提供更加可靠的依据。

综上所述，CNV-seq 与染色体核型分析对于产前染色体畸变的检测各有优势，CNV-seq 技术有它的局限性和风险［9］，特别是对于CNV-seq 检测结果为临床意义不明的病例，因其预后不确定性给孕妇及家属带来了焦虑，也给产前咨询医师提出了挑战。当胎儿检出临床意义不明的变异时，应该获取父母血样判断来源。如果是新发突变，多考虑为致病性变异，预后差。如果是从表型正常的父母那里遗传的，多倾向于良性变异；但部分的染色体微缺失、微重复导致的疾病存在表现度与外显率的差异，同一疾病在不同患者中的临床表型可能会存在较大的差异。因此，合理使用产前诊断技术，才能真正的提高染色体异常的检出率，从而降低出生缺陷。