打顶涂抹生长素对烤烟上部叶内源激素和光合作用的影响

刘一凡，李淮源，单雪华，雷 佳，姚 强，叶卫国，郭 维，陈建军

(1 华南农业大学 烟草研究室，广东 广州 510642；2 湖南省烟草公司衡阳市公司，湖南 衡阳 421001；3 广东中烟工业有限责任公司，广东 广州 510385)

打顶是烤烟生产中一项必要的田间管理措施，是调控烟株生长、提高烟叶品质的关键技术。由于打顶消除了顶端优势，使烟株的物质代谢中心发生变化，腋芽快速生长，生产上一般使用抑芽剂来抑制腋芽生长。然而抑芽剂的使用会对烤烟和土壤环境带来安全性方面的危险，增加吸食的潜在危害性，不符合“绿色烟草”的发展要求[1]。打顶同时改变了烤烟的“库-源”关系，引起烟株内源激素含量的变化，打破了烟株内源激素的平衡[2]，而缺少“顶端优势”的烤烟无法有效诱调营养至上部叶，导致上部叶内含物质少，烟叶小而轻，开片度也较低[3]。

烤烟的生理代谢过程与植物内源激素有关[4]。植物体内激素种类繁多，各种激素通过相互促进或者相互拮抗的方式对植物的生长发育进行调控[5-6]。目前有关生长素与烤烟的研究主要集中在生长素对烤烟化学品质的影响[7-8]，生长素的使用方式也以喷施为主[9]。光合效率是影响烟叶产量和品质的关键因素，目前有关烤烟光合特性的研究主要集中在氮肥水平[10]、客土[11]和种植密度[12]等方面，缺乏内源激素与光合特性相关性的研究。李春俭[13]指出，植物顶端产生或外源施用的生长素可将植物生长所需的营养物质调向生长素产生或施用的部位，从而使植株的茎顶端在一定程度上继续保持顶端优势，并抑制侧芽生长。外源激素是对内源激素的补充[14]。本研究以烤烟品种‘K326’为材料，在打顶伤口处涂抹生长素，在烟株建立“人工顶端”，分析打顶涂抹生长素对烤烟内源激素和光合特性的影响，探索调控上部烟叶生长的技术和方法，以期为今后优质上部叶的生产提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试烤烟(NicotianatabacumL.)品种为‘K326’，其种子由广东烟草韶关市有限公司提供。供试化学试剂吲哚乙酸(分析纯)，购自上海麦克林生化科技有限公司；超高效液相色谱仪-三重四极杆串联质谱仪，美国安捷伦公司生产；Li-6400型光合作用仪，美国Li-COR公司生产。

1.2 试验设计

试验于2019年在华南农业大学试验基地进行，采用随机区组设计，以生长素用量为试验因素，设置4个处理：常规打顶，打顶伤口不施用生长素(CK)；打顶时于伤口处涂抹0.5 mg 的25 mg/kg生长素(T1)；打顶时于伤口处涂抹0.5 mg 的50 mg/kg生长素(T2)；打顶时于伤口处涂抹0.5 mg的100 mg/kg 生长素(T3)。每个处理重复3次。每个小区面积60 m2，株距0.6 m，行距1.2 m，种植100株，共12个小区，小区四周设两行保护行。1月1日育苗，3月23日移栽，5月31日打顶。打顶前每个小区随机选取9株烟株，留叶16 片，统一打顶后按试验设计涂抹生长素，并挂牌标记。其他田间管理按照优质烟叶生产方案执行。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 烟叶内源激素含量测定 分别于涂抹生长素后第7，14，21，28，35天上午10:00-11:00，摘取处理烟株自上而下第3叶位烟叶，放入液氮速冻，带回实验室，在超低温-80 ℃下保存。取保存烟叶，参考陈千思等[15]的方法提取内源激素，采用HPLC-MS/MS分析测定吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)的含量。HPLC-MS/MS质谱条件见表1。

表1 烟叶内源激素含量测定的HPLC-MS/MS质谱条件Table 1 HPLC-MS/MS analysis of mass spectrometry conditions for determination of endogenous hormones in tobacco leaves

1.3.2 烟叶光合特性测定 分别于涂抹生长素后第0，7，14，21，28，35天上午10:00-11:00，选取处理烟株自上而下第3叶位烟叶，使用Li-6400型光合作用仪测定净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)，人工控制光照强度为1 000 μmol/(m2·s)，CO2浓度为400 μmol/mol。

1.3.3 烟叶农艺性状测定 分别于涂抹生长素后第7，14，21，28，35天选取处理烟株自上而下第3叶位烟叶，用卷尺测量叶长和叶宽，计算开片度和叶面积。

开片度=叶宽/叶长×100%，

叶面积=0.634 5×叶长×叶宽。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2013整理试验数据和绘图，采用SPSS 21.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶内源激素含量的影响

打顶涂抹生长素对烤烟上部叶内源激素含量的影响见图1。

图1 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶内源激素含量的影响Fig.1 Effect of auxin application on topping wound on endogenous hormones content of upper leaves of flue-cured tobacco

由图1可以看出，烤烟上部叶IAA含量随着生育期的推移呈上升趋势，处理后28 d时达到最大值，之后降低。在打顶涂抹生长素28 d时，涂抹50 mg/kg生长素的烤烟上部叶IAA含量达到了441.18 ng/g，较对照增加了88.72%。在其他时间点，涂抹生长素处理IAA含量与对照处理差异不显著。总体来说，打顶涂抹生长素可以提高烤烟上部叶IAA含量。

烤烟上部叶IBA含量随着生育期的推移呈“下降-上升-下降”趋势变化。涂抹生长素处理IBA含量7～14 d时下降；14 d后IBA含量升高；在28 d时达到最大值，涂抹50 mg/kg生长素处理最高，较对照增加27.78%，之后下降。在7和14 d，涂抹生长素处理IBA含量高于或显著高于对照，表明涂抹生长素可提高烤烟上部叶IBA含量。

烤烟上部叶ABA含量随生育期的推移呈“双峰”趋势变化，在14和28 d时出现峰值。在涂抹生长素后7 d，烟叶ABA含量低于对照，在14 d时50 mg/kg生长素处理显著低于对照，28 d后各生长素处理ABA含量均低于对照。说明打顶涂抹生长素降低了烤烟上部叶的ABA含量，在一定程度上延缓叶片的衰老。

随着生育期的推移，涂抹生长素处理烤烟上部叶SA含量呈下降趋势。在处理后7 d，生长素处理SA含量均显著高于对照，其中涂抹50 mg/kg生长素的烤烟上部叶SA含量达到了2 722.95 ng/g，较对照增加122.75%。在14 d后，对照SA含量均高于涂抹生长素处理，且在14和28 d时差异显著，表明打顶涂抹生长素降低了烤烟上部叶SA含量。

2.2 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶光合特性的影响

由图2可以看出，打顶涂抹生长素对烤烟上部叶光合特性有明显影响。随着生育期的推移各处理烤烟上部叶Pn呈“下降-上升-下降”趋势变化。在处理7 d后，对照Pn显著低于各处理；在21 d后涂抹50 mg/kg生长素烤烟上部叶Pn最高，达到了22.5 μmol/(m2·s)，较对照增加63.99%。总体来说，打顶涂抹生长素可以提高烤烟上部叶Pn，有利于烤烟上部叶有机物的合成。

图2 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶光合特性的影响Fig.2 Effect of auxin application on topping wound on photosynthesis of upper leaves of flue-cured tobacco

随着生育期的推移各处理Gs变化趋势一致，均表现为“下降-上升-下降-上升”趋势。在7 d后，涂抹生长素处理Gs均高于对照；在14 d后涂抹50 mg/kg生长素烤烟上部叶Gs达到了530.33 μmol/(m2·s)，较对照增加23.17%。总体来说，打顶涂抹生长素可以在一段时间内提高烤烟上部叶Gs，但是随着生育期的推移，效果逐渐降低。

随着生育期的推移各处理Ci变化趋势一致，表现为“下降-上升-平缓”趋势。 各处理Ci在0～7 d迅速下降，7 d至21 d迅速升高，21 d后逐渐趋于平缓，且差异不显著。总体来说，打顶涂抹生长素对烤烟上部叶Ci影响不显著。

随着生育期的推移各处理Tr呈下降趋势。14～21 d，对照处理Tr迅速下降，而涂抹50 mg/kg生长素烤烟上部叶Tr上升；在21 d，涂抹50 mg/kg生长素烤烟上部叶Tr达到了4.9 mmol/(m2·s)，较对照增加44.97%，且差异显著；在35 d，各处理无显著差异。总体来说，打顶涂抹生长素可以减缓Tr的下降趋势，涂抹50 mg/kg生长素可以推迟Tr下降。

2.3 打顶涂抹生长素烤烟叶片内源激素与光合特性的相关性

由表2可以看出，烤烟上部叶IAA含量与Pn显著正相关， IBA含量与Pn和Gs显著正相关，ABA与Gs极显著负相关。

表2 打顶涂抹生长素烤烟叶片内源激素与光合特性的相关性Table 2 Correlation between endogenous hormones and photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco with auxin application on topping wound

2.4 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶生长发育的影响

打顶涂抹生长素对烤烟上部叶生长发育的影响见图3。

图3 打顶涂抹生长素对烤烟上部叶生长发育的影响Fig.3 Effect of auxin application on topping wound on growth of upper leaves of flue-cured tobacco topping wound

由图3可以看出，随着生育期的推移烤烟叶片的长度和宽度呈上升趋势，且各涂沬处理均高于对照。在35 d，涂抹50 mg/kg生长素的叶长和叶宽最高，达到了74.2和28.93 cm，较对照增加5.55%和11.27%，且差异显著，而涂抹25和100 mg/kg生长素的叶长和叶宽与对照差异不显著。

随着生育期的推移涂抹25和50 mg/kg生长素烤烟叶片的开片度呈上升趋势，且各涂抹处理高于对照，而7～14 d涂抹100 mg/kg生长素的开片度呈下降趋势，之后呈上升趋势。在35 d，涂抹生长素处理叶片的开片度差异不显著，但均显著高于对照，其中涂抹50 mg/kg生长素的开片度最高，达到了39%，较对照增加5.5%。

随着生育期的推移烤烟叶片的叶面积呈上升趋势，且各涂抹处理均高于对照。在7 d，涂抹50 mg/kg生长素的叶面积高于其余处理，且差异显著。在35 d，涂抹50 mg/kg生长素的叶面积达到了1 362.23 cm2，较对照增加17.4%，且与对照差异显著，而涂抹25和100 mg/kg生长素的叶面积与对照无显著差异。

3 讨 论

外源激素可以改变烤烟体内各激素含量，从而引起烤烟光合生理发生改变。本试验结果表明，打顶涂抹生长素可以提高烤烟上部叶的IAA和IBA含量，这与代晓燕等[16]的研究结果一致。在打顶涂抹生长素35 d时，各处理烟叶的IAA和IBA含量无显著差异，这可能与外源生长素对烤烟内源激素的影响具有时间限制有关。光合能力的不足是限制烤烟上部叶品质的重要因素，光氧化是光合生产力与产量的重要限制因素。水稻幼叶的相关试验表明IAA可缓解光氧化，而ABA则会加速光氧化[17]。通过打顶涂抹生长素可以提高烤烟上部叶的Pn，且IAA和IBA含量均与Pn显著正相关，说明外源生长素可以提高烤烟上部叶光合生产能力，这与王玲等[18]通过施用外源生长素增加水稻剑叶Pn的结果相一致。本研究中ABA含量与Pn负相关，这与林勇明[19]的研究结论雷公藤光合作用与ABA含量呈正相关关系相反，这可能与植物种类及其生育期的不同有关。但涂抹生长素浓度过高，烤烟上部叶的Pn反而减少，甚至在一些时间段低于常规打顶的Pn，这可能与IAA的两重性有关。

植物顶端产生的IAA向下极性运输时造成的浓度梯度可以决定矿质元素和同化物质在植物体内的运输方向和分布，并且IAA可以通过影响同化物在韧皮部的运输机制来控制茎中的营养梯度[20-21]。打顶限制了光合产物向烤烟生殖生长点的运输，使上部叶既是“源”又是“库”，但同时摘除了IAA产生的部位，去除了烟株的“顶端优势”，使烟株体内极性运输的IAA减少，营养成分无法有效运输至上部叶。打顶涂抹生长素在去除生殖生长的基础上补充了烟株的IAA含量，使烟株重新建立“人工顶端优势”，这不仅提高了烤烟上部叶光合产物的积累，同时通过增加烟株体内极性运输的IAA，提高了光合主要产物蔗糖在韧皮部的装入速率[22]，加强了营养物质向上的诱调，使上部叶得到充分发育，增加了上部叶的叶长、叶宽和叶面积，有利于烤烟上部叶质量的改善。本研究结果表明，涂抹50 mg/kg生长素后35 d烤烟叶长和叶宽较对照分别提高5.5%和11.27%，说明外源生长素对烤烟上部叶叶宽的增加强于叶长，有利于上部叶的开片。叶片传导CO2和H2O的能力主要由Gs反映, 植物可以通过调节气孔的开关和大小控制CO2和H2O的交换频率[23]。ABA可以通过控制气孔径和应激反应基因表达限制CO2进入叶片，从而降低光合速率[24]。通过打顶涂抹生长素可以降低烤烟上部叶ABA含量，同时增加烤烟上部叶Gs，这与陈爱国等[25]的研究结果一致。说明打顶涂抹生长素可以逆转由ABA引起的气孔关闭或气孔径的减小，解除ABA对烟叶光合速率的限制，这与蚕豆上的研究结果一致[26]。但同时注意到，处理后14 d即各处理ABA含量的峰值，仅涂抹50 mg/kg处理IAA显著低于常规打顶，这可能是因为只有适宜浓度的外源生长素可以有效且持续地减少烟叶内ABA含量。

烟叶成熟的过程就是其衰老的过程，叶片衰老过程中常伴随着内源激素含量的变化[27]，而ABA具有促进烟叶衰老的作用[28]。小麦的相关试验显示，外源生长素可抑制衰老相关基因的表达, 延缓其叶片衰老进程[29]。植物衰老与其体内多胺水平下降有关，而多胺广泛存在于有激素参与的生长旺盛和分裂活跃的细胞组织中，并且可以起到清除自由基和稳定膜结构的作用。叶片中的IAA可以促进植物组织中游离多胺的合成，而ABA对其合成起抑制作用[30]。说明打顶涂抹生长素可以通过增加IAA含量、降低ABA含量延缓烟叶的衰老，加强烤烟上部叶光合作用的时间。

SA 是广泛存在于植物体内的一种小分子酚类化合物[31]。一些试验认为SA可以提高烤烟超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,以及抗坏血酸(AsA)含量，有利于清除活性氧的危害，延缓衰老，从而促进光合作用，加强叶片生物量的积累[32-33]。但是蚕豆的相关试验则指出，SA通过抑制CAT活性和诱导NADPH氧化酶活性来诱导活性氧信号H2O2的产生，H2O2会通过抑制质膜内K+电流而介导SA诱导气孔关闭[34]，而通过施用ABA合成抑制剂能阻断SA诱导的H2O2积累和胞间Ca2+升高，进而阻断SA诱导的叶片气孔关闭[35]。本研究在打顶涂抹生长素7 d后，随着外源生长素浓度的增加，烤烟上部叶SA含量呈上升趋势，说明通过打顶涂抹生长素可以提高其抗氧化能力，以应对打顶带给烟株的胁迫；但是当浓度过高，烟叶SA含量反而下降，且高于常规打顶水平；而之后胁迫减少，SA含量显著降低，烟叶由于胁迫导致的气孔关闭得到解除，恢复正常生长。

4 结 论

为提高烤烟上部叶可用性，本试验通过在打顶伤口处涂抹生长素建立“人工顶端”，可以增加烤烟上部叶IAA和IBA的含量，减少ABA的含量，延缓衰老，加强光合产物积累，提高开片度和叶面积。在本试验条件下，涂抹50 mg/kg生长素效果最好。