棉花RAV基因家族鉴定及其对石墨烯处理的表达响应

刘泽慧，刘 锐，王君玲，白秀丽，陈志文*，赵建国，吴佳文，常蕊蕊，钟世平

（1.石墨烯林业应用国家林业和草原局重点实验室，山西大同大学炭材料研究所，山西大同 037009；2.山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

碳纳米材料是指分散相尺度至少有一维小于100 nm的碳材料，包括纳米金刚石、纳米碳纤维、碳纳米管、石墨烯、富勒烯等，由于其种类繁多、结构独特、性能优异等特点，在物理、材料、化学、生物医学等多个领域都有研究应用。

作为二维的碳纳米材料代表，具有高比表面积、高导电率、化学稳定性好等特点，石墨烯在很多领域得到研究和应用。目前石墨烯对植物影响的研究相对来说比较少。石墨烯是碳原子以六边形蜂窝状矩阵连接在一起，以sp2杂化方式存在，每个碳原子的pz轨道垂直于石墨烯层，在表面形成多原子离域大键，ZHAO等[1]研究发现阳离子与石墨烯离域大键的相互作用可以提高含石墨烯水系统（如分离膜、吸附剂）的稳定性、选择性和吸附能力；石墨烯比表面积大且表面有多种含氧物质官能团，使石墨烯能够吸附肥料并缓慢释放肥效[2]。LIU等[3]研究石墨烯对水稻（Oryza sativa L.）萌发和幼苗形态的影响时发现，当石墨烯为低浓度5 mg/L时，观察到对不定根数、根鲜重和地上部分鲜重的促进作用，而在100 mg/L和200 mg/L等高浓度下，水稻各生长指标均受到抑制。郭绪虎等[4]发现4.00和8.00 mg/L的石墨烯溶液可以促进藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）组培苗根系的生长和发育，且增加了藜麦幼苗的生物量。SHEN等[5]研究不同浓度氧化石墨烯对5个品种水稻（Ory⁃za sativa L.）根系影响时，证实低浓度（5 mg/L）的氧化石墨烯对2个品种水稻根长有促进作用，对其他3个品种水稻根长有抑制作用，而高浓度（50 mg/L）的氧化石墨烯处理对5个品种水稻根系生长都有抑制作用。这些研究表明石墨烯对植物生长的影响受植物种类和品种、石墨烯浓度等多种因素影响。总的来说，低浓度石墨烯可以促进某些植物种子萌发、根和茎的生长，并促进生物量的增加，而高浓度的石墨烯则对植物生长有抑制作用，所以我们需要寻找石墨烯促进植物生长的最佳浓度。

棉花是我国重要的经济作物，主要分布在长江流域、黄河流域、西北内陆。目前国产棉花不能满足国内需求，每年有30%的国内棉花需求依赖进口，成为继大豆、食用油后第三大进口农作物。棉田黄萎病呈发展态势，2012年，全国棉田流行黄萎病约3 000万亩[6]，导致棉田减产15%～20%。由于黄萎病的危害，加上大幅度增长的原棉需求和5×106t的原棉缺口，使我国棉花安全面临着很大威胁。随着抗虫棉的推广普及，棉铃虫被基本控制，但是农药使用量大幅度下降，导致原来零星发生的蚜虫、盲蝽象、烟粉虱等刺吸式次生害虫逐渐上升为主要害虫，危害逐年加重，棉田面临药量使用反弹问题[6]。

植物体内的一些基因能够对各种生物和非生物胁迫做出快速的应答，从而使植物适应逆境带来的伤害，其中重要的调节因子是转录因子。根据转录因子保守DNA结合域的不同可分为WRKY家族、bZIP家族、MYB家族、AP2/ERF家族等[7]，而RAV是AP2/ERF家族的RAV亚家族类[8−9]。卢合均[10]通过对陆地棉接种黄萎病后分析发现RAV基因上调对棉花抵抗黄萎病有积极作用。目前还未有文献研究石墨烯和植物RAV基因家族的响应关系。本研究利用不同质量浓度的石墨烯溶液处理棉花幼苗，寻找表型最好的一个实验组，通过利用qRT−PCR技术检测棉花RAV基因家族17个基因的表达量，以期寻找棉花根系RAV基因家族17个基因中响应石墨烯的靶基因，为石墨烯提高棉花抗逆性提供理论基础。

1 试验部分

1.1 试验场地和试验材料

本研究于2019年5−6月在大同大学炭材料研究所院内试验地内进行，以陆地棉种子为试验材料，石墨烯由大同大学炭材料研究所以电化学法制备而成。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花种植与试验设计

按照完全随机区组的方法将60颗大小一致的棉花种子分为6组，每组10颗，分别标记为空白组和实验组（6组），所有棉花种子均培养在土壤中。

1.2.2 数据获取

棉花RAV基因家族序列是从PlantTFDB v5.0数据库（Plant Transcription Factor Database）与Cottongen数据库（https：//www.cottongen.org/）中下载得到。

1.2.3 进化树构建

使用MEGA−X软件中内置MUSCLE软件进行序列比对。在系统发育分析中，利用PHYLOGENY做进化树分析，分析参数用1 000 Bootstrap值，构建进化树。选用陆地棉作进化分析。

1.2.4 引物设计

棉花RAV基因序列下载自Cottongen数据库，利用CDS序列文件来设计qRT−PCR的引物，引物设计工具为NCBI−primer balst。

1.2.5 石墨烯处理

取一定量5.00 g/L的石墨烯溶液分别稀释300、250、200、150、100和50倍，对应的质量浓度分别为16.00、20.00、25.00、50.00和100.00 mg/L。实验组，将5个不同质量浓度石墨烯溶液分别浇灌于对应实验组的棉花幼苗根部，分4次浇灌，从播种开始每隔1周浇灌1次，每次浇灌体积1 L，浇灌时间18：00；空白组，浇灌溶液为等量的蒸馏水，其余处理与实验组一致。

1.2.6 RNA提取与qRT−PCR分析

从土壤中挖出对照和石墨烯处理的棉花根系，用蒸馏水冲洗干净，立刻冻于液氮中，随后置于−80 ℃超低温冰箱保存，用以提取RNA。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。具体实验步骤为：

（1）反转录：依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA;

（2）扩增：用PCR的方法扩增cDNA;

（3）检测：实时检测和定量扩增的产物;

（4）以陆地棉组蛋白HIS3mRNA(GenBank登录号AF024716)作为内部对照。

对各反应的解离曲线进行评价，采用周期阈值(CT)2−ΔΔCT法计算各靶基因的表达水平。

2 结果

2.1 不同植物中RAV基因家族基因数量

从植物转录因子数据库下载25种植物RAV家族基因（表1），这25种植物涵盖了被子植物20种，包括基础被子植物无油樟1个，单子叶植物4种，双子叶植物16种，苔藓植物1种，藻类植物3种等。可以看到，藻类植物中不含有RAV基因，甘蓝型油菜中所含RAV基因最多。本实验所要研究的陆地棉中，此种基因数量多达17个。

2.2 进化分析

根据上述的分析结果，我们选取陆地棉的RAV基因，用以做进化分析。如图1所示，17个RAV家族基因可以分为4支，陆地棉的17个RAV基因分布于Clade I，II，III和IV中。

2.3 确定棉花中的RAV基因家族

为了探究这17个RAV棉花基因是否可以响应石墨烯处理，我们从Cottongen棉花数据库下载陆地棉基因组测序CDS序列文件，利用CDS序列文件来设计qRT−PCR的引物，见表2。这些引物用以石墨烯处理棉花幼苗根系后，利用RT−PCR技术分析17个陆地棉RAV基因的表达量。

表1 25种植物RAV家族基因数量

图1 陆地棉中17个RAV基因家族进化树分析

2.4 不同浓度的石墨烯处理棉花种子

不同浓度石墨烯溶液通过根部浇灌棉花及幼苗，待长到幼苗期后观察其表型。本试验设置6个石墨烯质量浓度，分别为0、16、20、25、50、100 mg/L，浇灌棉花根系共4次，1次/周，然后利用根系扫描仪分析棉花根系发育状态，包括根长，根系体积，根系表面积等。如图2所示，25 mg/L的石墨烯可以显著促进棉花根系的发育，包括根长、根体积，并且可以促进地上部分茎的伸长，因此在后续基因表达实验中，将25 mg/L的浓度定位最佳石墨烯促进浓度。提取对照与最佳石墨烯浓度处理的棉花根系RNA，反转录成DNA，利用表2设计的引物，对棉花RAV家族基因表达量分析，以确定响应石墨烯的RAV基因。

图2 不同石墨烯处理后的棉花幼苗根系

2.5 棉花RAV基因响应石墨烯的表达谱特征

提取对照与最佳浓度石墨烯处理的RNA，经过qRT−PCR实验检测，发现4个基因的表达量发生了上调，包括Gh_D13G0717、Gh_A13G2131、Gh_A05G0119、Gh_D05G0181。其中与对照组相比Gh_D13G0717上调约4倍，Gh_A13G2131上调约7倍，Gh_A05G0119上调约5倍，Gh_D05G0181上调约10倍。由此推测这些基因为棉花根系响应石墨烯的靶基因，可能石墨烯通过促进这4个基因的表达量上调而促进了其根系的发育，进一步加强棉花植株的抗逆能力。

3 讨论

薛斌龙等[11]研究发现适宜石墨烯可以有效缓解氯化钠胁迫对树莓组培苗的伤害，提高组培苗抗盐能力；胡晓飞[12]在研究石墨烯防治枯萎病作用过程中，发现石墨烯可以抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发；HE等[13]研究表明石墨烯作为抗菌剂可以延长鲜切花的寿命。这些结果说明适宜浓度的石墨烯不仅可以促进某些植物生长，而且还可以提高一些植物的抗盐、抗菌能力。

对于石墨烯对植物抗逆性影响研究方面，YIN等[14]研究认为石墨烯具有较大的比表面积、大量的含氧官能团和较强的吸附能力可以将过多的盐离子吸附在石墨烯表面，从而提高植物的抗逆性。胡晓飞认为石墨烯的抗菌性是有2种原因：一是石墨烯表面的含氧基团（−COOH和−OH）解离，导致石墨烯本身呈酸性，不适宜尖孢镰刀菌生长；二是石墨烯片层较大，附着于菌体表面，造成细胞膜翘起，损坏菌体结构，不利于形成孢子。本研究从RAV基因家族表达量切入，研究石墨烯和植物抗逆性之间的关系。通过过逆转录定量PCR检测后，发现RAV基因家族中有4个基因的表达量上调，表明此基因家族确实响应石墨烯，这就从基因角度说明石墨烯有利于棉花的抗逆性和促进植物生长，从而达到提高了棉花产量的目的。

表2 RAV家族基因引物设计

4 结语

本研究通过对棉花中RAV基因家族数量进行鉴定，找到了17个RAV基因；在棉花幼苗处于幼苗期时，用不同浓度的石墨烯进行处理，证明25 mg/L是最佳浓度；利用qRT−PCR技术检测石墨烯处理的棉花根系组织的RAV基因表达量，结果表明4个基因发生了石墨烯诱导的表达量上调，验证了石墨烯处理会影响棉花RAV家族基因的表达。