基于多波长融合的菟丝子多成分定量方法研究

王亚楠，包永睿，2，3，王帅，2，3，李天娇，2，3，孟宪生，2，3*（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连6600）

2020年版《中国药典》一部收载的菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australisR.Br.或菟丝子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟种子[1]。菟丝子，始载于《神农本草经》，并被列为调元上品，具有补肝肾、益精明目、安胎等功效，是补肾壮阳的常用中药。临床常用于肝肾不足、腰膝酸软等。菟丝子主要含有黄酮类、有机酸类、植物甾醇类、生物碱类、多糖类等多种化学成分，黄酮类包括金丝桃苷、紫云英苷、山柰酚、异鼠李素、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2 →1）-β-D-芹糖苷等[2-3]。现代药理研究表明，菟丝子具有提高心血管系统功能[4-5]、降血糖[6-7]、增强机体免疫力[8]、抗癌[9]、保肝[10]、明目等多种药理作用。菟丝子是《太平圣惠方》收载抗衰益寿方剂中出现概率最多的药物之一，有研究表明，菟丝子具有抗衰老作用[11-12]。菟丝子有关黄酮类以及酚酸类成分的含量测定研究已有文献[13-15]报道，本研究在此基础上，通过色谱条件的进一步优化，采用HPLC 法以及多波长融合技术联合测定菟丝子中绿原酸、异绿原酸C 以及3 种有代表性的黄酮类成分（金丝桃苷、异槲皮苷及山柰酚）的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和OpenLAB CDS色谱工作站），HS6150 型超声波清洗器（天津恒奥科技发展有限公司），CP225D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

金丝桃苷、异槲皮苷、异鼠李素、槲皮素、山柰酚、紫云英苷、绿原酸对照品（批号分别为19103001、18062702、20090205、19082203、20082105、19042203、18071907，成都普菲德生物技术有限公司，纯度均≥98%），异绿原酸C（批号：wkq18050905，四川维克奇生物科技有限公司）异绿原酸C 的纯度为98%。乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯，水为超纯水。

菟丝子药材购自阳光大药房，购有内蒙古、辽宁、河北以及安徽产地的菟丝子，经辽宁中医药大学张建奎教授鉴定均为旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent proshell 120 SB-C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），流动相B 为乙腈，A 为0.2%甲酸水，梯度洗脱（0～5 min，7%～11%B；5～8 min，11%～15%B；8 ～12 min，15%～15%B；12 ～16 min，15% ～18%B；16 ～23 min，18% ～20%B；23 ～33 min，20% ～27%B；33 ～40 min，27%～35%B），进样量5 μL，流速0.6 mL·min－1，柱温30℃，检测波长237 nm、360 nm。

2.2 供试品溶液的制备

称取菟丝子粉末（过四号筛）1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，超声处理40 min，放冷，滤过，挥干，用80%甲醇复溶，定容至10 mL 量瓶中，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、山柰酚、槲皮素、异鼠李素、绿原酸、异绿原酸C 对照品适量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素、绿原酸、异绿原酸C 的质量浓度分别为75.45、25.8、46.1、26.1、13.47、18.04、40.9、11.4 μg·mL－1的混合对照品溶液。

2.4 全时段多波长信息融合方法

通过DAD 检测器对菟丝子色谱图进行紫外全波长（200 ～400 nm）扫描。根据扫描结果确定融合波长为237 nm、360 nm。分别从Agilent 1260 色谱工作站中导出237 nm、360 nm 的dif 格式数据文件，使用Matlab 软件编程，将导出的数据进行全时段多波长信息融合后，获得了一组图谱文件和一张同时反映两个波长信息的色谱图，样品及混合对照品色谱图见图1。共标定12 个色谱峰，通过与对照品比对，识别出8 种成分。

2.5 指标性成分确认

质谱条件：正离子模式 Agilent Proshell SBC18色谱柱（3 mm×100 mm，2.1 μm），流动相B 为乙腈，A 为0.2%甲酸水，梯度洗脱程序同“2.1”项下洗脱条件，流速0.4 mL·min－1，柱温30 ℃，进样量1.5 μL。电喷雾离子源（ESI），正离子模式检测，干燥气流速13 L·min－1，干燥气温度350℃，毛细管电压3.5 kV，雾化器压力310.28 kPa，碎裂电压125 V，二级质谱碰撞电压40 eV，采集范围m/z100 ～1000。

将内蒙古菟丝子药材供试品溶液与混合对照品溶液进行UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析，得正离子模式下的总离子流图，见图2。根据药材供试品溶液化学成分的保留时间（tR）和质谱信息，结合混合对照品的二级质谱碎片信息进行比对，鉴定出以上8 个指标性成分，见表1。

图1 样品与对照品高效液相色谱图Fig 1 HPLC of the sample and the reference

图2 菟丝子供试品（A）及混合对照品（B）正离子模式下总离子流图Fig 2 Total ion current Cuscutae semen sample（A）and mixed reference （B） in positive ion mode

表1 正离子模式下菟丝子指标性成分鉴定Tab 1 Identification of index components of Cuscutae semen in positive ion mode

2.6 线性关系考察

精密量取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、异绿原酸C、山柰酚对照品适量，加甲醇溶解制成混合对照品储备液（每1 mL 含绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、异绿原酸C 和山奈酚分别为320.72、483.60、246.40、182.40 和215.52 μg）；精密量取上述混合对照品储备液适量，逐级稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液（绿原酸320.72、160.36、80.18、40.09、20.05、10.02 μg·mL－1；金丝桃苷483.60、241.80、120.90、60.45、30.23、15.11 μg·mL－1；异槲皮苷246.40、123.20、61.60、30.80、15.40、7.70 μg·mL－1；异绿原酸C 182.40、91.2、45.6、22.8、11.40、5.7 μg·mL－1；山 柰 酚215.52、107.76、53.88、26.94、13.47、6.74 μg·mL－1）；分别精密吸取上述混合对照品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，以质量浓度X（μg·mL－1）对峰面积Y进行线性回归，绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚的回归方程分别为Y＝12.66X＋12.07（r＝0.9994）、Y＝21.15X＋5.868（r＝0.9999）、Y＝18.64X－42.05（r＝0.9991）、Y＝19.19X－11.10（r＝0.9994）、Y＝64.66X＋4.12（r＝0.9998）。结果表明5 种成分峰面积在线性范围内与质量浓度的线性关系良好。

2.7 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液5 μL 连续进样6次，测定绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚峰面积，结果峰面积RSD值分别为0.45%、0.36%、0.45%、0.81%、0.64%，表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验

按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，于室温放 置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.1” 项 下色谱条件测定峰面积。结果绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚24 h 内峰面积的RSD分别为0.63%、0.72%、0.95%、0.41%、0.68%，表明样品溶液在24 h 内稳定。

2.9 重复性试验

按照“2.2”项下方法同时制备6 份供试品溶液，照“2.1”项下方法分别进样5 μL，测得绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷和山柰酚的峰面积RSD分别为1.8%、0.26%、1.7%、0.43%和0.97%。表明该方法重复性好。

2.10 耐用性考察

考察不同柱温（25、28、30 ℃）对检测结果的影响，发现柱温为30 ℃时，色谱峰的分离度好；考察不同流速（0.6、0.8 mL·min－1）对检测结果的影响，发现流速为0.6 mL·min－1时，色谱峰均能达到良好分离；考察不同型号色谱柱（Agilent proshell 120 SB-C18色谱柱以及Agilent proshell 120 EC-C18色谱柱）对检测结果的影响，结果选择Agilent proshell 120 SB-C18色谱柱。

2.11 加样回收试验

精密称取已知含量的菟丝子药材粉末6 份，每份约0.5 g，分别加入混合对照品溶液1 mL（金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚、绿原酸、异绿原酸C 分别为1.780、0.3240、0.2810、1.1040、0.0320 μg·mL－1的混合对照品溶液），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、异绿原酸C、山柰酚的平均加样回收率分别为99.4%、100.0%、98.9%、99.6%和129.0%，RSD分别为0.0040%、0.018%、0.017%、0.029%和0.019%。

2.12 样品含量的测定

取不同产地菟丝子药材1 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算样品中绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

本研究在前期试验基础上，通过优化色谱条件，标定12 个色谱峰，通过对照品定性比对，识别出酚酸类和黄酮类共8 种化学成分，分别是绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素。绿原酸具有抗氧化[16]、抗癌抗诱变、抑菌作用[17]，绿原酸还具有降血糖[18-19]、减轻脂肪沉积、调节免疫的作用[20]，其对认知神经系统有重要影响[21]。异绿原酸除具有抗氧化、抗病毒、消炎等生物活性外，还具有抑制组胺释放、抗纤维化、抑制平滑肌收缩等作用。黄酮类成分是菟丝子的主要有效成分，现代药理学研究表明[4-12]菟丝子具有保护生殖系统、提高心血管系统功能、调节血脂、降血糖、增强机体免疫功能、抗氧化、抗衰老、抗癌等多种药理作用。黄酮和酚酸类化学成分是菟丝子中主要有效的药理活性成分，具有改善心肌缺血、调节机体免疫及内分泌等多种功能。且这几种成分在药材中含量高、易检出，其分离度、对称性好，临床药理作用广泛，能够代表菟丝子的整体药效。因此选取这些指标成分进行定量研究。

表2 不同产地菟丝子药材5 种成分含量测定结果(mg·g－1)Tab 2 Determination of 5 components in Cuscutae semen from different origins (mg·g－1)

表3 不同单一波长下5 种成分的含量测定结果(mg·g－1)Tab 3 Determination of 5 components under different single wavelengths (mg·g－1)

3.2 样品处理条件的选择

分别考察了乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇的提取效果，结果发现80%甲醇提取效果最好，确定80%甲醇为提取溶媒；分别考察了10、30、50 倍量的提取溶剂，发现50 倍量溶剂提取充分；通过对30、40、60 min 不同超声时间进行筛选，发现超声处理40 min 时，菟丝子已提取较完全。最终确定采用50 mL 80%甲醇超声提取40 min。

3.3 全时段多波长融合指纹图谱融合方法的意义

以往的文献报道多采用高效液相色谱法，选取黄酮类成分中的一种或多种化合物为测定指标来控制菟丝子及其制剂的质量[22-23]。潘杰等[24]通过UPLC 法建立了菟丝子饮片的指纹图谱，标定了10 个共有峰；但是在不同色谱条件下使用不同前处理方法对菟丝子中绿原酸、异绿原酸C、金丝桃苷、异槲皮苷和山柰酚5 种成分分别进行检测，无法实现对菟丝子指纹图谱进行全面和整体评价，因此，本研究遵循信息最大化原则建立菟丝子药材全时段双波长融合指纹图谱并对其指标成分进行含量测定。

中药指纹图谱是评价和控制中药质量与活性的有力手段之一，目前所见的中药指纹图谱大多是单张的色谱图，当中药化学成分复杂时，单张的化学指纹图谱难以完整展现药物的化学组成特征，因此需要建立多元指纹图谱，即将多张反映药物中各类成分化学组成特征的指纹图谱融合在一起，共同表征药物完整的化学组成，形成多元指纹图谱。本研究将237 nm、360 nm 两个波长下的图谱数据进行全时段融合，得到一张同时包含两个波长信息的色谱图，可以克服单一波长指标检测时信息量不足的缺点，表征不同类成分的特征吸收，实现对菟丝子指纹图谱的全面、整体评价。

本试验还运用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术，根据精确相对分子质量、质谱碎片结构和保留时间等信息，结合对照品的裂解规律，对HPLC 法识别出的指标性成分进行进一步确证。不同产地菟丝子的含量测定结果显示，5 种成分含量存在差异，以绿原酸为对照，分别计算不同产地以上4 种成分相对于绿原酸的相对含量，对以上成分的相对含量取均值并下调60%，拟定菟丝子药材中5 种指标相对含量之和应不低于1.87%。菟丝子药材中尚存在一些响应较好的色谱峰为未知成分，有待进一步研究。