染料木黄酮对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

易佩佩，赵英琦，丁吉雪，陈文君，陈婉榕，王梦璇，吕元明（桂林医学院公共卫生学院，广西 桂林541000）

乳腺癌（breast cancer）是女性发病率最高的肿瘤，同时也是女性肿瘤相关死亡的主要原因之一[1]。乳腺癌的复发与转移是导致患者死亡的主要原因，研究发现高达70%的淋巴结阳性和高达30%的淋巴结阴性乳腺癌会在治愈后复发[2]，而更严重的是肿瘤一旦发生转移，中位生存期仅为2 ～3年，这是目前临床治疗面临的一大难题。

染料木黄酮（genistein，GEN）是异黄酮类化合物，在豆荚类植物中广泛存在，属于植物雌激素的一种，具有抗氧化、保护心血管、预防骨质疏松、抗肿瘤等药理作用，还可作为辅助化疗药发挥作用[3-4]。已有研究证明GEN 通过NF-κB和AKT 途径抑制乳腺癌细胞增殖，还与乳腺癌中雌激素受体结合从而对相关炎症基因产生影响[5]。上皮间质转化（EMT）在癌症中被广泛研究，并被认为在侵袭、转移、化疗耐药性和与癌细胞侵袭性有关的过程中起着至关重要的作用[6]，但GEN 在调节乳腺癌细胞EMT 过程方面的作用仍不清楚。因此本实验从EMT 过程探究GEN 对两种乳腺癌细胞生物学特性的影响及相关分子机制，探讨GEN 抗乳腺癌的作用机制，为乳腺癌的临床治疗提供新思路。

1 细胞与试药

MCF-7 细胞和MDA-MB-231 细胞（American Type Culture Collection，ATCC）；GEN、CCK-8试剂盒（美国MCE）；DMEM 培养基、胎牛血清（美国Gibco）；线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒（中国碧云天）；ECL 超灵敏化学发光检测试剂盒（上海雅酶）；DMSO（美国Sigma）；4%多聚甲醛（美国Solarbio）；β-actin、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（北京中杉金桥）；Caspase 3、BAX、Bcl-XL、Bcl2（武 汉Proteintech）；E-钙调蛋白（E-Cadherin）、Vimentin、N-钙黏蛋白（N-Cadherin）（美 国CST）；Twist、MMP-2、MMP-9、Snail、Slug（英国ABcam）。

2 方法

2.1 细胞增殖实验

取对数生长期细胞，以每孔200 μL（约含5000 个细胞）接种于96 孔板内，每组设置3 个复孔。次日，吸出孔内培养基，按组别分别加入100 μL 配好含0[对照组（control）]、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培养基，同时设置不含细胞及无任何处理的空白对照组。分别培养0、24、48、72 h 后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于培养箱4 h 后在酶标仪450 nm 波长下检测吸光度。

2.2 平板克隆形成实验

取对数生长期细胞按每孔1000 个细胞接种于6 孔板，放入细胞培养箱。次日，按设定药物浓度加入GEN，放于培养箱内培养12 ～15 d。弃掉旧培养基，1×PBS 缓冲液洗涤后4%多聚甲醛溶液固定20 min，1×PBS 缓冲液洗涤3 遍，每孔加入650 μL 结晶紫染色30 min，置于通风处晾干后拍照并对克隆形成数量进行统计。

2.3 细胞凋亡实验

取对数生长期的乳腺癌细胞，以每孔1×105个接种于12 孔板中。细胞过夜贴壁后分别以含0（对照组）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的培养基继续培养48 h。使用线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒染色，随即在荧光显微镜下进行观察拍照。

2.4 细胞划痕实验

6 孔板内每孔接种乳腺癌细胞6×105个，培养至汇合度达到95%以上，用黄色枪头沿孔中线划一条线，1×PBS 缓冲液清洗2 遍。分别加入含0（对照组）、12.5、25、50 μmol·L－1GEN 的DMEM 培养基（不含血清）2 mL，继续培养。划痕后0、24、48、72 h 定点显微镜拍照记录，用Image J 软件处理图像并计算相对细胞迁移率。

2.5 Transwell 实验

取对数生长期的细胞消化离心，用GEN 浓度分别为0（对照组）、12.5、25、50 μmol·L－1的含2%胎牛血清的DMEM 培养基重悬细胞。按药物浓度梯度依次向各小室内对应加入含5×104个细胞的200 μL 细胞悬液，24 孔板孔内加入500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培养基。培养48 h后PBS 缓冲液轻柔洗涤2 次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，随后结晶紫避光染色20 min，PBS缓冲液洗涤3 次，在倒置显微镜下任意选取3 ～5个视野拍照计数，重复实验3 次。铺胶小室实验需提前将Matrigel 基质胶铺于各个小室上室的聚碳酸酯膜上，其他操作与未铺胶相同。

2.6 Western blot 蛋白质印迹法

3 个浓度组的GEN 处理乳腺癌细胞48 h 后。使用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度：10% SDS-PAGE 进行电泳分离并转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，放入对应一抗中4 ℃冰箱孵育过夜。TBST 洗膜，二抗室温孵育1 ～2 h 后TBST 洗膜4 次，发光机内发光，分析条带灰度值，计算蛋白质相对含量。

2.7 统计学方法

采用SPSS Statistics 21.0 和GraphPad Prism 8 软件对实验数据进行统计学分析。定量数据用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度GEN 对乳腺癌细胞增殖能力的影响

CCK-8 实验结果显示，随着GEN 浓度增加，乳腺癌细胞增殖能力随之降低。平板克隆形成实验结果显示，随着GEN 浓度增加，乳腺癌细胞MCF-7 及MDA-MB-231 的克隆形成能力逐步降低，见图1。

图1 不同浓度染料木黄酮对乳腺癌细胞增殖的影响（n ＝3）Fig 1 Effect of different concentrations of GEN on the proliferation of breast cancer cells（n ＝3）

3.2 不同浓度GEN 对乳腺癌细胞凋亡的影响

细胞经过不同浓度的GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）处理48 h 后，置于镜下观察结果。与对照组相比，随着药物浓度的增加，发出强烈绿色荧光的凋亡细胞数量逐渐增加，而红色荧光的活细胞也出现减弱或者呈现阴性，见图2。

3.3 不同浓度GEN 对乳腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响

划痕实验结果如图3 所示，与对照组相比，GEN 作用下乳腺癌细胞的愈合速度减低，特别在25、50 μmol·L－1浓度下愈合能力均有明显的抑制（P＜0.01）。Transwell 未铺胶及铺胶小室实验结果分别见图4 和图5：与对照组相比，GEN 处理组穿过小室的细胞数均有明显减少，同时穿过小室的细胞数量与药物浓度成反比（P＜0.01）。

3.4 不同浓度GEN 对乳腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图2 染料木黄酮对乳腺癌细胞凋亡的影响（×100）Fig 2 Effect of GEN on the apoptosis of breast cancer cells（×100）

图3 染料木黄酮对乳腺癌细胞迁移能力的影响（×40）（n ＝3）Fig 3 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells（×40）（n ＝3）

图4 Transwell（未铺胶）小室实验检测染料木黄酮对乳腺癌细胞迁移能力的影响（×200）（n ＝3）Fig 4 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（without glue）（×200）（n ＝3）

图5 Transwell（铺胶）小室实验检测染料木黄酮对乳腺癌细胞迁移能力的影响（×200）（n ＝3）Fig 5 Effect of GEN on the migration of breast cancer cells by Transwell test（with glue）（×200）（n ＝3）

不同浓度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）处理乳腺癌细胞48 h，凋亡相关蛋白表达结果如图6所示，随着GEN 浓度增加，两种细胞中Caspase 3、Cleaved-caspase 3、BAX 蛋白表达水平升高，Bcl2、Bcl-XL 蛋白表达水平降低，BAX/Bcl2 比例增加。

3.5 不同浓度GEN 对乳腺癌细胞侵袭迁移相关蛋白表达的影响

不 同 浓度GEN（12.5、25、50 μmol·L－1）处理乳腺癌细胞48 h 后，对其侵袭相关蛋白表达水平的影响。结果如图7 所示，随着GEN 的药物浓度增加，E-Cadherin 表达升高，N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低（见图7）。

4 讨论

目前乳腺癌的临床治疗多采用手术配合放化疗的综合疗法，但由于化疗药价高且副作用强，因此对不良反应少，来源广泛、价格低廉又易于获取的新型低毒高效药物的开发研究仍是抗乳腺癌研究中的重点。流行病学数据研究发现高异黄酮的摄入可能会降低乳腺癌发生的风险[7-8]。GEN 作为一种天然的异黄酮类化合物，在自然界中广泛存在，已有研究证明其在口腔癌[9]、结肠癌[10]、甲状腺癌[11]等肿瘤细胞中具有一定的抑制作用。本课题组研究发现GEN 能够抑制乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 细胞的增殖。

图6 染料木黄酮对乳腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响（n ＝3）Fig 6 Effect of GEN on the expression of apoptosis-related proteins in breast cancer cells（n ＝3）

图7 染料木黄酮对乳腺癌细胞侵袭转移相关蛋白表达的影响（n＝3）Fig 7 Effect of GEN on the expression of invasion and metastasisrelated proteins proteins in breast cancer cells（n ＝3）

最新研究发现GEN 能够通过Notch1/NF-κB/Slug/E-Cadherin 途径逆转上皮-间充质诱导结肠癌细胞凋亡[10]。乳腺癌死亡的主要原因就是局部复发与远处转移，因此乳腺癌的不易治愈与其浸润性和转移性密切相关，而EMT 是肿瘤侵袭迁移的重要驱动因素[12-13]。乳腺癌的EMT 过程中，作为细胞上皮表型的E-Cadherin 作用是维持细胞的形态和结构，上皮肿瘤细胞发生侵袭的前提就是E-Cadherin 丢失，因此其丢失是EMT 发生的生物标志物之一。当E-Cadherin 表达出现下调时，作为间质表型的N-Cadherin 表达会上调来与之达到平衡[14]。作为间质表型的波形蛋白（Vimentin），随着迁移能力的增加而表达上升，也被用来标记EMT 的发生。我们发现GEN 能抑制乳腺癌细胞的侵袭与迁移能力，显著促进上皮型蛋白标志物E-Cadherin 的表达，抑制间质型蛋白标志Vimentin、N-Cadherin 的表达。这提示GEN 能抑制肿瘤细胞EMT 的发展，从而减弱细胞的侵袭与迁移能力。

而EMT 的发生则与许多因子相关。基质金属蛋白酶（MMP）可以直接或间接诱导EMT 的发生。MMP 能够直接破坏细胞基底膜和细胞外基质成分，使恶性肿瘤细胞侵袭、转移[15]。而发生EMT 的必要条件则是损伤因素造成上皮组织基底膜结构的降解。此外，锌指蛋白转录因子（Snail、Slug）、bHLH 转录家族（E12、E47 及Twist）和ZEB 转录因子（ZEB1 和ZEB2）[16]也可以调控EMT 的发生。E-Cadherin 启动子区域元 件E-box 可与转 录因 子Snail、Slug 和Twist 相结合，抑制E-Cadherin 的转录，从而导致EMT的发生。Western blot 实验结果显示乳腺癌细胞加GEN处理后，MMP-2、MMP-9、N-Cadherin、Vimentin、Twist、Snail 和Slug 的表达减少。由此可见，GEN 可能通过调控MMP、锌指蛋白转录因子、Twis 转录因子对EMT 过程发挥抑制作用。

综上所述，本文首次提出来GEN 通过逆转EMT 过程抑制乳腺癌细胞MCF-7 和MDAMB-231 的迁移和侵袭，诱导凋亡，且MMP、锌指蛋白转录因子、Twis 转录因子在此过程中发挥了重要作用，为进一步明确GEN 这类植物雌激素对恶性肿瘤的影响提供了新的线索。但关于GEN 调控 EMT 过程的相关作用机制还有待后续深入研究，以期为乳腺癌的早期诊断与治疗提供更多的可能。