六味地黄丸含药血清通过Caspase-1/GSDMD-N通路对Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞损伤的影响

高琳琳，赵丹玉，冯晓帆，张林，朱仲康，张欣，柳春（辽宁中医药大学，沈阳 110847）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s diseases，AD）是老年人最常见的一种渐进性中枢神经系统疾病，临床上常表现为进行性记忆力障碍、认知功能障碍等[1]。据调查，目前全球有4680 万人患AD，预计至2050年，数值将达到1.3 亿多[2]。导致AD 的病理机制可能有β淀粉样蛋白（Aβ）沉积、Tau 蛋白的过度磷酸化、胆碱能神经元丢失等，其中Aβ沉积被广泛认为是AD 发病的关键[3-6]。

近些年来，细胞焦亡已成为当今医学界的研究热门，细胞焦亡作为一种新的细胞程序性死亡，是一种依赖于Gasdermin 蛋白家族的细胞免疫炎性反应而致的死亡。李昕[7]认为脑梗死患者的神经细胞可发生焦亡，发病的关键在于肝肾亏虚，用填精益肾的方法可改善此病，可见肾虚与焦亡具有联系。诸多实验表明，细胞焦亡可诱发细胞免疫炎性反应，与AD 的关系密切相关[8]。

传统医学对AD 早有记载，AD 属于中医“老年痴呆”范畴。中医学认为，痴呆的病机为髓减脑消，神机失用[9]。脑髓的减少是老年痴呆发病的关键，老年痴呆症的病位在脑，而五脏六腑的气血失调也可导致脑髓的减少。《灵枢》中记载“人始生，先成精，精成而脑髓生”，说明肾可主骨生髓，肾精与脑具有密切联系，痴呆的发生归于肾精的减少[10]。张娜等[11]通过相关研究证明地黄饮子具有滋肾阴、补肾阳的功效，可以有效地改善AD 的认知和记忆状态。六味地黄丸是滋阴补肾的经典名方，有滋阴填精、补益肝肾之功效，可以治疗肾阴精不足等症。王红梅等[12]研究发现六味地黄丸可通过补肾填精作用，来改善老年痴呆症状。崔勇[13]也认为六味地黄丸可以有效减轻中枢免疫反应，起到抑制AD 的作用。以上诸多研究表明，焦亡与炎性反应的关系十分密切，通过益肾填精可以减轻脑内炎性反应，进而改善AD 的发生发展，但益肾填精对于焦亡的调控鲜有报道。因此，本研究从Caspase-1/GSDMD-N 通路来观察六味地黄丸对焦亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物

健康雄性SD 大鼠30 只，SPF 级[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0002； 许可证号SYXK（辽）2015-0001，动物实验于中国医科大学实验动物部进行，伦理委员会批准号：IACUC.2018019]。

1.2 细胞株

人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y，江苏凯基生物技术股份有限公司）。

1.3 试药

六味地黄丸浓缩丸（北京同仁堂科技发展有限公司，批号：Z11021283，每8 丸相当于生药3 g）；Aβ1-42（美 国ANASPEC 公 司， 批 号：AS-20276）；胰蛋白酶（美国Gibco 公司，批号：25200-056）；PBS 缓冲液（美国HyClone 公司，批号：SH30256.01）；胎牛血清（FBS）（塞尔乐生物科技有限公司，批号：F41704）；IL-1β、IL-18酶联免疫试剂盒（上海酶联生物有限公司，批号分别为ml058059、ml058055）；Caspase-1（批号：ab207802）、GSDMD-N（批号：ab215203）（英国Abcam 公司）；高糖DMEM 培养基、全蛋白抽提试剂盒、Western 及IP 细胞裂解液、SDSPAGE 凝胶电泳试剂盒、BCA 蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号分别为KGM12800-500、KGP2100、KGP701、KGP113、KGP903）；Invent 总蛋白提取试剂盒（美国Invent公司，批号：SD001/SN002）；ECL 检测试剂盒（德国Millopore 公司，批号：WBKLS0100）；预染蛋白分子量（中国Bio-Platform，批号：Bpwb10102）。

2 方法

2.1 细胞培养

将SH-SY5Y 细胞用含10%FBS 的高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2 六味地黄丸含药血清的制备

SD 大鼠30 只，适应性喂养2 ～3 d 后，随机分为正常对照组和六味地黄丸组，每组15 只，分笼饲养，根据人与大鼠体表面积有效剂量换算，六味地黄丸组用含六味地黄丸生药量1.18 g·kg－1的六味地黄丸粉末水溶液灌胃（根据前期实验基础，筛选出最适浓度[14]），正常对照组用等体积量的双蒸水灌胃。连续灌胃1 周后，两组同时腹主动脉采血，室温静置2 h，2000 r·min－1离心10 min，分离血清，即得到正常对照血清和含药血清。血清于56℃，30 min 灭活，0.22 μm 滤膜过滤分装，置－80℃冰箱备用[14]。

2.3 细胞模型的制备

细胞实验分为正常对照组、模型组和六味地黄丸含药血清组3 组。正常对照组细胞加入含正常对照血清的完全培养基；模型组细胞加入含正常对照血清的完全培养基和20 μmol·L－1的Aβ1-42；含药血清组细胞加入含六味地黄丸的含药血清（根据预实验CCK-8 结果，确定六味地黄丸含药血清筛选的最终浓度为100%）的完全培养基和20 μmol·L－1的Aβ1-42。

2.4 台盼蓝染色法检测细胞成活率

弃去培养液，用PBS 清洗细胞一遍，加入台盼蓝染色3 min 后，弃去染液，镜下观察细胞状态，计算活细胞与死细胞数量，活细胞率＝活细胞总数/总细胞数×100%。

2.5 ELISA 法检测IL-1β 和IL-18 的含量

取细胞上清液，按照ELISA 试剂盒说明书测定IL-1β和IL-18 的含量。

2.6 Western blot 法检测Caspase-1、GSDMD-N 蛋白的表达

Invent 试剂盒法提取蛋白，用BCA 法进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法电转移到PVDF 膜上，将 PVDF 膜放入平皿中，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡，封闭1.5 ～2 h。将膜放入含一抗的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜，次日吸弃一抗，TBST 洗5 min×3 次。再用5%脱脂奶粉封闭液稀释二抗（1∶8000），室温摇床振荡反应 1 ～2 h，用 TBST洗膜5 ～10 min×3 次。显色，凝胶成像仪成像。用Gel-Pro Analyzer 4 软件对结果进行灰度分析。

2.7 统计分析

运用SPSS 22.0 统计学软件对实验结果进行统计分析，采用单因素方差分析方法（ANOVA），以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 台盼蓝染色结果

镜下观察，正常对照组细胞形态较好，结构清晰，胞体饱满，有突触，透光度好，成透明状；模型组细胞外形不规则，胞膜不完整，细胞碎裂，见大量碎片流出，细胞成圆形，无突触，死细胞较多，被染成蓝色；含药血清组细胞形态相对较好，结构比较清晰，胞体相对饱满，仅有少量碎片，有突触，少数被染成蓝色。与正常对照组相比，模型组细胞成活率显著降低，与模型组相比，含药血清组细胞成活率显著增高（见表1 及图1）。

表1 各组细胞实验结果(±s，n ＝3)Tab 1 Cell experiment results of each group (±s，n ＝3)

表1 各组细胞实验结果(±s，n ＝3)Tab 1 Cell experiment results of each group (±s，n ＝3)

注（Note）：与正常对照组相比，*P ＜0.01；与模型组相比，#P ＜0.01（Compared with the normal control group，*P ＜0.01；compared with the model group，#P ＜0.01）。

组别 活细GSDMD-N/β-actin正常对照组 95±3.61 37.46±0.40 33.99±0.92 0.41±0.09 0.37±0.06模型组 59±3.61* 45.63±1.04* 39.83±0.92* 1.31±0.21* 0.88±0.05*含药血清组 87±2.65# 40.80±0.60# 36.46±0.62# 0.66±0.08# 0.48±0.06#

图1 各组台盼蓝染色情况（200×）Fig 1 Trypan blue staining in each group（200×）

3.2 各组细胞上清液中IL-1β 和IL-18 的含量

与正常对照组相比，模型组上清液IL-1β和IL-18 的含量增多（P＜0.01）；与模型组相比，含药血清组上清液IL-1β和IL-18 的含量下降（P＜0.01）。见表1。

3.3 各组细胞Caspase-1、GSDMD-N 蛋白表达的结果

与正常对照组相比，模型组Caspase-1 和GSDMD-N 的蛋白表达显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，含药血清组Caspase-1 和GSDMD-N的蛋白表达显著降低（P＜0.01）（见表1 及图2）。

4 讨论

AD 的发病率随着社会发展明显升高，其病理机制尚不明确，可能与Aβ沉积，Tau 蛋白过度磷酸化，神经细胞自噬，焦亡，氧化应激等有关[15-16]，早期防治AD 已成为医学界急需解决的问题。

图2 各组细胞的Caspase-1 和GSDMD-N 蛋白表达的情况Fig 2 Expression of Caspase-1 and GSDMD-N protein in each group A.正常对照组（normal control group）；B.模型组（model group）；C.含药血清组（drug containing serum group）

细胞焦亡与AD 具有密切联系，AD 发生时，其病理产物Aβ异常增多聚集，形成外在的老年斑，同时也激活炎性小体，引发焦亡相关通路[17-18]。Aβ作用于SH-SY5Y 细胞时，会激活NOD 样受体中的NLRP1 受体蛋白，NLRP1 广泛存在于大脑神经元中[19-20]。NLRP1 与凋亡相关微粒蛋白（又称接头蛋白，ASC）和效应蛋白Caspase-1 前体（Pro-caspase-1）结合成多蛋白复合物NLRP1 炎性小体（inflammasome）[8]。炎性小体激活Pro-caspase-1 形成Caspase-1。Caspase-1把焦亡的执行者GSDMD 裂解为GSDMD-C 端和GSDMD-N 端[21]。GSDMD-N 的出现可引发细胞焦亡，并在膜上形成孔隙，破坏细胞膜结构[22]，而Caspase-1 又可剪切细胞内IL-1β和IL-18 的前体，使其生成IL-1β和IL-18 并释放到细胞外，引起细胞炎性反应[23]。陈倢[24]研究发现六味地黄丸可调整机体细胞免疫炎性反应，调节学习记忆能力，从而改善AD 的状态。六味地黄丸最早见于《小儿药证直诀》，是补阴的经典要方[25]。此方由6 味药组成，3 味补药，3 味泻药。补药为熟地黄、山萸肉和山药，此三药相伍，可补益肝脾肾，即为三阴并补；泻药为泽泻、牡丹皮和茯苓，均为佐药。三补三泻，以补为主。在中医看来，AD 是由髓减脑消、肾精不足导致的，而六味地黄丸正是滋阴补肾、填精益髓的重要方剂。崔勇[13]研究认为六味地黄丸可有效抑制细胞炎性反应，进而改善AD。由此可知，六味地黄丸可能在抑制焦亡炎性反应上，发挥了重要作用（见图3）。

图3 炎性反应机制与含药血清作用Fig 3 Mechanism of inflammatory response and the effect of drug containing serum

本实验运用益肾填精的方法，探讨六味地黄丸含药血清对AD 细胞模型焦亡的影响。六味地黄丸含药血清浓度筛选预实验中，将血清稀释成25%、50%和100% 3 个剂量组，根据CCK8 结果显示，100%含药血清组（增殖率97.72%）相比于25%（增殖率83.79%）、50%（增殖率87.60%）含药血清组的细胞增殖率要明显增高（P＜0.01），所以最终选择了100%含药血清组。台盼蓝结果显示，模型组细胞成活率降低，而含药血清组细胞成活率增高，提示六味地黄丸可以保持细胞膜的完整性，抑制细胞的死亡，与文献报道一致[26]；Western blot 和ELISA 实验结果显示，与正常对照组相比，模型组Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18 表达均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，含药血清组Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18 表达均显著降低（P＜0.01），提示六味地黄丸可抑制焦亡通路上的相关蛋白，对神经细胞的焦亡具有明显改善作用。李昕[7]研究发现神经细胞焦亡时，主要病机在于人体的肝肾亏虚，运用填精益髓、补益肝肾的方法可改善此状态。综上可得，六味地黄丸可明显降低焦亡相关通路上的蛋白，进而抑制免疫炎性反应，对AD起到了积极改善的作用，为今后AD 的治疗研究提供依据。