基于化学计量学的金钗石斛不同加工品和干燥品的红外光谱分析

张悦，陈莹，郭怡博，魏鑫鑫，陈建波，孙志蓉*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.北京中医药大学生命科学院，北京 0488）

金钗石斛Dendrobium nobileLindl.是药用石斛的基原植物之一，为我国传统名贵中药材，以地上茎入药，干鲜两用，具有益胃生津、滋阴清热的功效[1]，其主要有效成分为金钗石斛多糖、生物碱等[2]，是石斛夜光丸、脉络宁注射液等中成药的主药，可开发为以金钗石斛为原料的胶囊、含片等保健品，市场需求量大[3-4]。目前，金钗石斛已实现人工规模化栽培，主要产区有贵州、四川、云南等地，其传统初加工方法为“除去杂质→脱叶鞘→杀青→发汗→整形→干燥”[5]，加工环节复杂，加工量少且费时费力，加上金钗石斛鲜茎的表皮致密，茎内部含大量水分，自然晾干或烘干的干燥时间较长且生产效率低，如何在保证金钗石斛品质前提下精简加工环节、提高干燥和产出效率成为石斛产业规模化发展亟需解决的问题。然而，对石斛产地初加工的研究主要集中在加工工艺对其加工品外观形状、色泽等物理性状和多糖、生物碱等有效成分含量的影响[5-7]，对不同加工和干燥方法处理的金钗石斛加工品整体化学成分指纹图谱的研究较少。

傅里叶红外光谱（fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）可以反映中药谱图的整体化学成分信息，具有整体、快速、无损鉴别的特点[8-9]，同时结合相似度评价、聚类分析、主成分分析等化学计量学方法，可以挖掘中药材原始光谱的潜在信息[10]，在中药材真伪鉴别[11-12]、样品产地快速鉴别[13-14]、药材质量评价[15-17]等方面均有应用。本文以不同加工和不同干燥方法处理的金钗石斛加工品和干燥品为研究对象，应用傅里叶红外光谱和相似度评价、主成分分析与聚类分析化学计量学方法，比较不同加工和干燥方法对金钗石斛整体化学指纹图谱的影响，探究红外光谱法在鉴别和评价金钗石斛加工品质量方面应用的可行性，为金钗石斛不同加工品和干燥品的质量评价与控制提供参考。

1 材料和方法

1.1 样品来源和加工

金钗石斛样品分别于其采收期（10月份）采自贵州赤水市旺隆、官渡、鸭岭和红花4 个金钗石斛种植基地，经北京中医药大学中药学院孙志蓉教授鉴定为金钗石斛Dendrobium nobileLindl.的新鲜茎。

按文献[5]中金钗石斛加工方法处理得到1 ～9 号加工品（见表1）。金钗石斛不同干燥品制备方法如下：烘干品（H1 ～H5）经55 ℃鼓风烘干后粉碎得到；冻干品（D1 ～D5）经冷冻干燥（－60℃、1 Pa 下预冻7 h，干燥10 h）后粉碎得到；榨汁后喷雾干燥品（Z1 ～Z5）经榨汁机榨取汁液后，喷雾干燥而得。

表1 样品信息表Tab 1 Sample information

1.2 仪器与试药

METTLER-AE240 型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；DHG-9140A 鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；LGJ-12 冷冻干燥机（松源华兴公司）；ZN-02 小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；Spectrum GX FTIR 红外光谱仪（美国Perkin Elmer），DTGS 检测器；溴化钾（KBr，纯度为99.9%，化学试剂研究所）；金钗石斛多糖为课题组自制（质量分数＞98%）[18]。

1.3 红外光谱测定方法

1.3.1 红外图谱扫描 研磨溴化钾空白片，扫描本底。将适量药材粉末与溴化钾混合研磨（样品与溴化钾之比约为2∶100），压片，扫描，获得样品的红外一维谱图。扫描条件：光谱测量范围4000 ～400 cm－1，光谱分辨率为4 cm－1，扫描信号累加16 次，扫描时实时扣除水和二氧化碳的干扰。

1.3.2 仪器精密度考察 同一金钗石斛样品，按照“1.3.1”项下方法压片后检测，连续扫描5次，对所得图谱进行相似度比较，其相关系数为0.9997 ～1.000，结果表明仪器精密度良好。

1.3.3 样品重现性考察 分别取同一批金钗石斛样品5 份，按照“1.3.1”项下方法分别压片后测定，对所得图谱进行相似度比较，其相关系数为0.9920 ～0.9999，结果表明样品具有良好的重现性。

1.3.4 数据分析 采用Perkin-Elmer 公司的Spectrum V6.3.5 操作软件，对样品进行数据采集和图谱预处理，预处理过程包括基线校正、归一化和比对。采用Spectrum V6.3.5 软件进行相关性分析，并利用其求导功能得到样品的二阶导数光谱，平滑点数为13。分别应用SMICA 14.1 软件和SAS 8.2 软件对样品红外光谱数据进行主成分分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 金钗石斛不同加工品和干燥品的红外光谱比较

2.1.1 一维红外光谱图比较 9 种不同加工方法处理的金钗石斛样品的一维红外光谱见图1，可知9 种加工品之间的一维光谱图差异较小，峰位和峰形较为相似，相似度为0.9828 ～0.9988（见表2），说明不同加工品主体化学成分相似。对各加工品红外图谱共有峰进行归属（见表3），结果表明9 种加工品的红外光谱峰在2852 cm－1处有所不同，水烫＋烘干（5）、水烫＋发汗＋烘干（6）、40℃真空干燥（7）的2852 cm－1左右处谱峰较为明显，而其他加工品在此处谱峰较弱。2923 cm－1与2852 cm－1分别为亚甲基的碳氢反对称伸缩振动峰与对称伸缩振动吸收峰，归属为长链化合物，推测上述3 种金钗石斛加工品长链化合物较多。

3 种干燥方法处理的金钗石斛干燥品一维红外图谱见图2，可知金钗石斛烘干品与冻干品红外光谱整体上相似度较高，相似度为0.9522 ～0.9972（见表4），组内相似度分别为0.9697 ～0.9972 和0.9812 ～0.9985。榨汁后喷雾干燥品红外光谱与前两者差异较大，表现为无1739、1506、1461、1331 cm－1峰，而在900 cm－1之后峰要相对多些，可能原因是石斛水提取物进行喷雾干燥获得样品较其他干燥方法成分损失较多[19]。对比金钗石斛多糖红外图谱，1739 cm－1左右为金钗石斛多糖的酯羰基C ＝O 伸缩振动吸收峰，950 cm－1以下为糖环骨架振动吸收的多个指纹特征峰，1600 ～1300 cm－1为芳香类物质特征谱段[20]，1506 cm－1为芳香环骨架伸缩振动吸收峰，1461 cm－1附近的吸收峰可能为芳香环骨架伸缩振动或C-H 弯曲振动，1331 cm－1处为C-H 弯曲振动吸收峰，推测榨汁后喷雾干燥品的金钗石斛多糖、芳香类物质的种类及含量与冻干品、烘干品可能存在差异。由表4 可知，榨汁后喷雾干燥品组内相似度为0.8900 ～0.9933，与其他2种干燥方法样品相似度为0.6687～0.8329，验证其化学成分的种类与含量有所不同，可以与另外两种加工品区分。

表2 9 种加工品一维红外光谱之间相关系数Tab 2 Correlation coefficients among the one-dimensional infrared spectra of 9 processed products

图1 9 种加工品的一维红外谱图Fig 1 One-dimensional infrared spectra of 9 processed products

表3 金钗石斛加工品红外光谱各吸收峰官能团的振动方式及主要归属Tab 3 Vibration mode of absorption peak functional group and the main peak attributable of processed products of Dendrobium nobile Lindl.

2.1.2 红外二阶导数光谱图比较 红外二阶导数图谱可以将谱图中的重叠峰进一步分开，增大谱图分辨率[20]。选择9 种金钗石斛加工品差异较大的波段1800 ～800 cm－1进行二阶求导得到9种加工品二阶谱图（见图3），结果在波数1060、1035 cm－1处，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋发汗＋烘干（3）、水烫＋砂炒＋烘干（4）的吸收峰较强，其他6 种加工品吸收峰较弱。传统加工（1）、水烫＋烘干（5）、水烫＋发汗＋烘干（6）在1740 ～1593 cm－1及1593 ～1515 cm－1有许多明显的小峰，以水烫＋发汗＋烘干（6）的吸收峰最强。二阶导数图谱中1593 cm－1、1559 cm－1、1508 cm－1为芳环骨架伸缩振动吸收峰，以及1737、1635 cm－1等C ＝O 伸缩振动吸收峰为金钗石斛内芳香类物质的指纹特征峰[20]。

表4 3 种干燥品一维红外光谱之间相关系数Tab 4 Correlation coefficients among the one-dimensional infrared spectra of 3 dried products

图2 3 种干燥品的一维红外谱图Fig 2 One-dimensional infrared spectra of 3 dried products

图3 9 种加工品的红外二阶导数谱图Fig 3 Infrared second derivative spectra of 9 processed products

通过二阶导数图谱（见图4），烘干与冻干品主 要 在1126、1107 cm－1处 和1054、1020 cm－1处的相对峰强存在差异。具体表现为烘干品在1126 cm－1与1107 cm－1吸收峰强度一致，冻干品在1107 cm－1峰强度弱于1126 cm－1。烘干品在1054 cm－1与1020 cm－1处吸收峰强度一致，而冻干品在1054 cm－1左右吸收峰强度弱于1020 cm－1处。上述吸收峰归属于金钗石斛多糖二阶导数特征峰，峰强差异说明烘干品与冻干品中金钗石斛多糖种类与含量可能存在差异。榨汁后喷雾干燥品与烘干、冻干品的差异明显，在1200 cm－1前只有1469 cm－1处峰较强，在1200 cm－1吸收峰都较弱，但榨汁后喷雾干燥品二阶导数光谱与金钗石斛多糖二阶导数光谱峰位与峰形相似度较高，可能与处理过程中多糖类成分溶出有关。

图4 3 种干燥品的红外二阶导数谱图Fig 4 Infrared second derivative spectra of 3 dried products

2.2 聚类分析和主成分分析

2.2.1 聚类分析 聚类分析可以将样本依据某些特征加以归类并建立样本与样本之间相似关系或亲疏关系[21]。以金钗石斛不同加工品和干燥品的红外光谱主要峰位的峰强数据为变量，导入SAS软件，以离差平方和法进行聚类分析，结果如图5 所示。当欧式距离为10.0 时，可分为两大类，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋发汗＋烘干（3）、水烫＋砂炒＋烘干（4）聚为一大类，其余为另一大类，可初步推测“砂炒”环节对金钗石斛的整体成分影响较大，为金钗石斛加工中较为重要的加工环节；当欧式距离为5.0 时，分为三类，第一类为传统加工（1）与水烫＋烘干（5），第二类为6、7、8、9，其中6 为水烫＋发汗＋烘干，与40 ℃真空干燥（7）、60 ℃真空干燥（8）、80 ℃真空干燥（9）在欧式距离为1.25 时区分，第三类为2、3、4，均具有“砂炒”环节。

3 种干燥品聚类见图5B，当欧式距离为13.0时分为两大类，第一类为烘干品（H1 ～H5）与冻干品（D1 ～D5），另一类为榨汁后喷雾干燥品（Z1 ～Z5）；当欧式距离为5.0 时，分为三类，第一类为烘干品（H4）与冻干品（D1 ～D5），第二类烘干其余4 个样品，第三类为榨汁后喷雾干燥的5 个样品。推测金钗石斛不同干燥品化学成分存在差异，其中烘干品、冻干品主体化学成分较为相近且与榨汁后喷雾干燥品明显区分。

2.2.2 主成分分析 主成分分析通过数据降维，用少量主成分来描述多种指标之间的联系，用较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息[22]。将金钗石斛不同加工品和干燥品的红外光谱主要峰位的峰强数据导入SMICA 14.1 软件进行主成分分析，结果如图6 所示。9 种不同加工品的2 个主成分累计贡献率达99.6%，3 种干燥品2 个主成分累计贡献率达到92.9%，可较好地反映金钗石斛不同加工品和干燥品红外光谱图信息。如图6A 所示，砂炒＋烘干（2）、砂炒＋发汗＋烘干（3）、水烫＋砂炒＋烘干（4）分布较为聚拢且与其他加工品距离较远，聚为一类；其余6 种加工方法聚为一类，其中40℃真空干燥（7）、60℃真空干燥（8）、80℃真空干燥（9）分布较为聚拢，上述结果与聚类分析的结果一致，验证推论。

图6B 中3 种干燥方法可得到较好的分离，除烘干样品H4 外，其他样品分别按3 种干燥方法组内聚拢，组间分离趋势明显，说明不同干燥方法处理的金钗石斛样品之间化学成分存在一定差异，与红外光谱及聚类分析结果一致。此外，5个冻干品分布较为集中，说明冻干工艺获得加工品的品质一致性较高，与相似度分析结果一致。

图5 不同加工品（A）和干燥品（B）的一维红外光谱聚类分析图Fig 5 Cluster analysis diagram of one-dimensional infrared spectra of different processed（A）and dried products（B）

3 讨论

本文在课题组前期探究传统加工、砂炒＋烘干等9 种加工方法对金钗石斛质量影响的基础上，进一步从药材整体化学指纹图谱的角度比较不同金钗石斛加工品化学信息的差异，结果表明采用红外光谱与化学计量学结合的方法可以实现对金钗石斛不同加工品质量的快速判别与评价。

从9 种加工品二阶红外导数光谱可以看出，其二阶红外导数光谱在1060、1035、1740 ～1593 及1593 ～1515 cm－1处图谱峰差异较大，可加以区分。具体表现在砂炒＋烘干、砂炒＋发汗＋烘干、水烫＋砂炒＋烘干在1060、1035 cm－1处峰强较强，传统加工、水烫＋烘干、水烫＋发汗＋烘干在1740 ～1593 cm－1及1593 ～1515 cm－1峰数较多。另外，本研究发现“砂炒”环节对金钗石斛的整体成分影响较大，兼具杀青、脱叶鞘、整形功能[5]，是金钗石斛加工中的重要环节。

图6 不同加工品（A）和干燥品（B）一维红外光谱主成分分析图Fig 6 Principal component analysis diagram of one-dimensional infrared spectra of different processed products（A）and dried products（B）

烘干品、冻干品与榨汁后喷雾干燥品可利用红外光谱法进行鉴别区分，榨汁后喷雾干燥品的一维红外光谱与烘干品和冻干品的差异明显，表现为无1739、1506、1461、1331 cm－1峰，而在900 cm－1之后峰要相对多些，可加以区分。烘干品与冻干品可利用二阶导数光谱1126 和1107 cm－1、1053 和1020 cm－1处的相对峰强加以区分。冻干品间均一性高，但榨汁后喷雾干燥品与其他2 种干燥品主体化学成分差异较大。传统烘干法操作简便、成本低且对于设备要求不高，适用于石斛药材加工[23]；冷冻干燥是在高真空度、低温条件下通过冻结升华方法脱去水分，可抑制微生物的生长和酶的作用，具有保持产品的色泽和品质的特点[24]，但其操作复杂，加工成本较高[25]，适用于石斛或其保健型食品的保鲜[26]；石斛榨汁后进行喷雾干燥获得的干燥品由于瞬时高温，干燥时间较短，可保持原有色泽且抗氧化活性较高，适用于石斛提取物相关产品开发[19]。因此在以金钗石斛为原料的加工过程中，可根据实际生产成本、生产目标与产品质量选择适宜的干燥方法以满足生产需要。