虎地肠溶胶囊对大鼠实验性结肠炎的疗效及机制的研究*

孔梦玉，刘晓芳，武金宝

(1.包头医学院2018级硕士研究生，内蒙古 包头 014060；2. 包头医学院第二附属医院病理科；3.包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性特发性炎症性疾病。在病理学上UC是一种局限于结肠黏膜和结肠黏膜下层的慢性炎症性肠病，累及部分或全部结肠，主要表现为腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便，其为慢性病程，病情轻重不等，有终生复发倾向。据报道，全球UC患病率为(2.42～298.5)/10万，其中北美和北欧的发病率最高，且UC在全球范围内发病率呈现上升趋势[1-3]。UC的发病机制尚未明确，目前认为由多种因素相互作用所致，包括肠上皮屏障破坏、肠道反应相关通路中的遗传缺陷、包括益生菌群失调在内的环境影响及免疫因素等[4-5]。目前，对溃疡性结肠炎的诊断、病程监测以及UC患者对干预措施的反应和粘膜愈合(MH)的检测依赖于临床评估、粪便或血清学生物标志物及结肠镜检查，其中结肠镜检查是“金标准”。

由于UC有反复发作，病程迁延的特点，故需要长期维持治疗。目前维持治疗用药选择依然有限，主要为氨基水杨酸制剂。虽然糖皮质激素、免疫抑制剂等药物对于UC也有较好的疗效，但由于有较多且严重的副作用，使它们不能用于UC的长期维持治疗。虎地肠溶胶囊具有清热、利湿、凉血的功效，其作为新型中药用于UC的临床治疗已经十余年，对于缓解UC患者腹痛、黏液脓血便的症状效果显著，尤其针对轻、中度UC具有较好的疗效，但对于其相关的研究报道较少，其作用机制尚不清楚。DSS饮水法被广泛应用于急、慢性结肠炎发病机制、药物药效的研究[6]。

因此本实验采用DSS饮水法建立UC大鼠模型，通过用虎地肠溶胶囊内容物干预造模大鼠，与对照组大鼠进行比较，选取大鼠一般情况、大便隐血评分、疾病活动指数评分(DAI)、组织病理学表现、反应肠上皮屏障功能相关因子(ZO-2、Occludin)、肠黏膜保护性因子(AQP4、HSP70)作为疗效评价指标，对比分析各组指标的差异，探究虎地肠溶胶囊对于大鼠实验性结肠炎的疗效及其可能作用机制，为UC的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1对象

1.1.1实验动物 SD大鼠30只，SPF级，雄性，体质量(160±10)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。 许可证号:SCXK (京) 2014-0004。北京市实验动物质量合格证号：No.114013000075657。质量检测单位为中国医学科学院实验动物研究所。

1.1.2药品和试剂 虎地肠溶胶囊(安徽九方制药有限公司，国药准字Z20020035，规格0.4 g/粒)，纯净水稀释，配置混悬液，按2.5 mg/g体重灌胃；4 %葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液(美国MP Biomedicals公司，批号216008120，分子量36 000～50 000)；兔抗大鼠多克隆TJP2(ZO2)抗体(货号GTX12276，批号821904953)、兔抗大鼠多克隆Hsp70抗体(货号GTX104126，批号43138)、兔抗鼠多克隆Occludin抗体(货号GTX114949，批号43670)、兔抗大鼠多克隆Aquaporin 4抗体(货号GTX133151，批号42640)。以上抗体均购置于美国Gene Tex公司。通用二步法试剂盒(鼠/兔增强聚合物法检测系统)购置于北京中杉金桥生物技术有限公司。抗体稀释液、DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复液、PBS磷酸盐缓冲液(粉剂)均购置于福州迈新生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组 将30只SPF级SD大鼠随机分为3组，分别为对照组、UC模型组、虎地肠溶胶囊治疗组，每组各10只。

1.2.2造模方法 采用DSS饮水法诱导大鼠溃疡性结肠炎模型。随机选取10只大鼠为对照组，给予自由饮水喂养7 d。余20只大鼠造模，给予自由饮用4 % DSS水溶液喂养7 d。造模第5 d，造模大鼠出现精神萎靡、活动减少、食量减少、出现稀溏血便等症状，表明造模成功。

1.2.3给药方法 造模成功后，治疗组大鼠给予虎地胶囊内容物混悬液按2.5 mg/g的剂量灌胃，对照组及模型组大鼠给予同等体积生理盐水灌胃，连续给药25 d。

1.2.4样本采集 末次给药后禁食24 h，脱颈处死大鼠，进行末次称重，取肛门至结肠末端，福尔马林液保存。

1.2.5观测指标 (1)一般情况：从造模第一天起每日观察记录各组大鼠进食饮水情况、精神状况、体重、粪便性状及粪便隐血情况，计算疾病活动指数(DAI=体重下降评分+大便性状评分+隐血评分)，参考熊骏[7]等评分标准。(2)结肠组织病理学改变：实验终点，取各组大鼠结肠病变部位组织或距肛门口1.5 cm处组织进行4 % 多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察，记录。(3)免疫组化检测:取各组大鼠结肠病变部位组织或距肛门口1.5 cm处组织进行4 %多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、烤片，免疫组化染色过程严格按照1.2中所述试剂盒说明书操作，AQP4、HSP70、Occlundin、ZO2抗体浓度均为1∶300，封片完成，显微镜下观察，并进行免疫组化评分，参考陈卫[8]等评分标准。

2 结果

2.1一般状况 实验期间对照组大鼠精神佳，毛色光亮，食量正常，大便为硬质椭球形，实验期间未出现稀溏血便。除对照组外，其余两组大鼠均在饮用4 % DSS水溶液后出现毛色晦暗、不喜动、食量减少、大便不成形等表现，几乎所有造模大鼠均在饮用4 % DSS水溶液第4 d时出现稀溏血便，部分大鼠肛门口可见血便附着，表示造模成功。治疗组大鼠在虎地治疗后精神、食量、大便情况逐渐好转，实验终点时为硬质椭球形便，隐血阴性。UC模型组大鼠毛色晦暗，精神差，进食量少，稀溏血便持续时间较长，实验终点时大便为松软成形便，隐血阴性。如图1所示，治疗组大鼠大便隐血评分在实验第11 d(即虎地灌胃治疗第4 d)时开始下降，实验第27 d评分降至0分，UC模型组大鼠实验第17 d时大便隐血评分开始下降，至实验终点评分为1分。

图1 每日记录各组大便隐血评分变化

2.2疾病活动指数 造模结束后，模型组和治疗组大鼠DAI均为4分，治疗组DAI于灌胃第5 d时下降，且与模型组相比出现显著差异(P<0.001，n=9),模型组DAI于灌胃第11 d下降，此后模型组与治疗组相比无显著差异(P=0.606，n=9)。结果如图2、表1所示。

图2 灌胃第1-11 d大鼠DAI变化(*P<0.001，#P=0.606)(n=9)

表1 灌胃期治疗组、模型组之间DAI的差异性分析M(Q1，Q3)

2.3组织病理学变化 光镜下观察三组大鼠结肠组织病理切片，部分病理切片见图3。结果如下：对照组大鼠结肠黏膜完整，肠腺整齐，黏膜无炎症细胞浸润；模型组大鼠结肠黏膜失去完整性，肠腺排列混乱，伴有黏膜糜烂，可见杯状细胞消失、隐窝结构消失，部分出现隐窝脓肿，肠黏膜大量炎症细胞浸润，部分结肠可见炎症浸润至黏膜肌层；治疗组大鼠结肠黏膜破坏程度较模型组轻，炎症细胞较模型组少，炎症局限于黏膜层。

图3 各组大鼠结肠组织HE染色×100注：A对照组：黏膜连续，隐窝结构完整；B治疗组：黏膜、隐窝结构较完整，少量炎症细胞局限于黏膜层；C、D模型组：黏膜糜烂、隐窝结构消失

2.4各组大鼠结肠AQP4、ZO-2、Occludin、HSP70表达情况 模型组大鼠结肠组织中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表达水平显著降低，与对照组相比有显著差异(P<0.05，n=10)。与模型组相比，虎地治疗组大鼠结肠组织中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表达水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05，n=10)。见表2。

表2 各组大鼠结肠组织Occludin、ZO-2、AQP4、HSP 70表达情况

3 讨论

溃疡性结肠炎(UC)作为一种反复发作，病程迁延的消化道疾病，对患者的健康、生活均造成了严重的影响，在过去的几十年里，越来越多的实验研究致力于解开UC发病的谜团，关于UC发生发展的病理生理学途径方面已经取得了很大的进展，目前认为肠上皮屏障破坏、免疫相关的细胞因子失衡在UC的发生发展中至关重要。

肠黏膜形成的一种选择性屏障，保护宿主免受腔内内容物和微生物的侵袭，同时允许营养物质、离子和水的自由流动，我们称之为“肠上皮屏障”。 肠上皮屏障功能在维持肠道健康中起着举足轻重的作用。当上皮屏障的完整性受到破坏，会导致肠黏膜通透性增高，微生物、毒素、病原体和过敏原进入黏膜组织和血液循环导致炎症的发生。肠上皮屏障主要由上皮细胞紧密连接(TJ)蛋白组成，如ZO-2、occludin和claudins等。这些TJ蛋白在形成和维持细胞旁屏障方面起着重要作用，紧密连接结构的破坏与UC炎症的启动和加速有关[9-10]。Kuo等[11]的实验显示在UC患者结肠组织中，occludin表达减少，导致caspase-3下调，从而限制上皮细胞凋亡，破坏黏膜动态平衡，并引起结肠炎。Chang等[12]研究表明与对照组相比，DSS处理组小鼠结肠组织occludin、ZO-2的表达均显著减少。

水通道蛋白4(AQP 4)、热休克蛋白70(HSP 70)作为两种重要的保护性因子广泛存在于全身各个组织脏器。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一种跨膜通道蛋白，负责水和/或小分子溶质跨细胞膜的高效、选择性转运，同时在调节细胞的体积和细胞内渗透压中起着关键的作用[13]。Hardin JA等[5]实验结果显示在DSS诱导小鼠结肠炎模型中，AQP 4的表达在DSS直接刺激12-24 h后显著降低，并在整个治疗期间保持抑制状态。热休克蛋白的功能主要是在各种生理应激条件下(如感染、缺血等)给予细胞保护，有着强大的抗炎作用，是机体关键抗炎分子之一[8-9]。肠道内的热休克蛋白以HSP 70为主。Barbatis C等[15]研究发现活动期UC炎症上皮HSP 70c表达下调。Ramakrishna等[14]免疫组化结果显示，DSS诱导结肠炎大鼠肠上皮细胞HSP 70的染色强度较低。

本实验研究结果显示模型组大鼠结肠组织中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70表达均较对照组显著降低，提示DSS可以导致大鼠上皮紧密连接结构受损、肠上皮屏障功能缺陷、抗炎因子缺失导致结肠炎症的发生。与此同时本实验中，虎地治疗组大鼠一般情况、大便隐血情况、疾病活动情况较模型组均有好转，组织病理学结果显示，治疗组黏膜损伤及炎症反应程度较轻。经虎地治疗后，大鼠结肠组织中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70含量均有显著增加。

综上表明，虎地肠溶胶囊对改善实验性结肠炎大鼠一般情况、大便隐血情况、疾病活动情况、组织病理学表现等方面具有一定作用。因此，我们推测虎地肠溶胶囊治疗UC的机制可能与增加AQP 4、HSP 70等肠黏膜保护性因子的表达对抗肠道炎症反应、增加肠上皮紧密连接蛋白修复受损的肠上皮屏障有关。