烟草内生细菌YN2014042对烟草、玉米的定殖和促生作用研究

杨珍福，何鹏飞，吴毅歆，何鹏搏，孔宝华,赵崇钧，刘剑金，何月秋

（1云南农业大学，昆明650201；2中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，昆明650221；3微生物菌种筛选与应用国家地方发酵工程研究中心，昆明650217；4云南省烟草公司普洱市公司，云南普洱665000）

0 引言

植物体内含有大量内生细菌，它们不但可以通过与病原菌竞争空间或产生拮抗物质抵御病虫害侵袭，还可以促进植物生长，是宝贵的天然生物资源，对其进行合理利用可减轻因使用化学农药和化学肥料造成的环境污染问题，因而被开发成生防菌剂和生物肥料等产品在农业生产中广泛应用[1-3]。Gao等[4]发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Em7对由核盘菌引起的油菜菌核病防效达到50%～70%；徐征等[5]发现一种内生巨大芽孢杆菌的菌肥肥效对反季节鲜食玉米品质提升效果显著；高振峰等[6]发现内生细菌ZSY-1对番茄灰霉病防效良好，叶部防效可达80.33%、果实防效可达75.10%；梁志超等[7]将内生解淀粉芽孢杆菌YN2014048添加到烟草育苗基质中制成微生物功能基质对烟苗促生作用显著。在内生细菌的应用过程中，能否在植株体内有效定殖是其发挥防控和促生作用的前提与关键因素[8]。生防菌田间应用时，由于根际定殖能力差而导致病害防治效果下降或防治失败的现象常有发生[9]；因此，定殖能力检测成为当前生防促生菌研究领域的热点之一。随着现代标记基因技术的建立与发展，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记法已成为深入研究生防菌在植物上的定殖、扩展和消长规律提供有效工具[10]。已有研究表明，一些具有生物防治作用的细菌通过GFP标记能在黄瓜[11]、马铃薯[12]、烟草[13]、西芹[14]等多种植物上成功定殖。

YN2014042（以下简称YN42）是从健康烟草植株中分离获得的一株解淀粉芽孢杆菌。它具有较强的抑菌活性，对烟草黑胫病有较好的防效[15]，对多种作物的生长有促进作用[16]。为了进一步开发利用YN42，本研究用GFP基因对其进行了标记，并利用平板分离法结合激光共聚焦显微镜对其在烟草和玉米上的定殖能力进行了初步研究；同时将YN42添加到烟草育苗基质中制成微生物功能基质以及用YN42对玉米进行灌根处理，研究其对烟草、玉米生长的影响，为该生防菌株和微生物肥料的开发及应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：YN42为烟草内生解淀粉芽孢杆菌，为云南农业大学植物保护学院分离保存。

供试作物：烟草品种云烟97由云南省烟草农业科学研究院提供、玉米品种广玉88为云南广大种业有限公司产品。

供试病原菌：13种植物病原真菌均为本实验室分离和保存（表1）。

表1 YN42的抑菌谱

续表1

其他材料：真菌和细菌培养采用PDA和LB培养基，自然转化生长采用GCHE和GC培养基[10]。质粒pHAPII由南京农业大学沈其荣老师惠赠，带有卡那霉素抗性基因和GFP基因。有机无机复混肥由云叶生物科技有限公司提供，漂浮育苗基质由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司提供，育苗盘为162孔泡沫育苗漂盘。

1.2 方法

1.2.1 YN42的GFP标记 采用Idris等[17]的两步法转化YN42。将转化成功的单个GFP标记菌落，接种于100mL不含卡那霉素的LB培养液中，30℃，150 r/min，培养24 h，从中取10 μL培养液转接至不含卡那霉素的LB培养液，连续转接培养5次后，取100 μL培养液，涂布于不含卡那霉素的LB平板，30℃，倒置培养24 h。随机选100个标记菌株单菌落划线接种于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板，以抗性菌株所占百分比来计算菌株质粒的遗传稳定性。

1.2.2 GFP标记菌株抑菌活性检测 以1.1材料中的13种病原真菌为试验材料，PDA平板中心接活化的病原真菌，采用平板对峙试验比较GFP标记菌株YN42-GFP和野生型YN42菌株对病原真菌的抑菌活性。以仅接病原真菌为空白对照，各处理重复3次，25℃培养。当空白对照的病原菌长满平板时，观察并测量接种拮抗菌的培养皿中拮抗带的宽度。对比两者的拮抗带宽度，得出标记菌是否具有相同或者更强的拮抗能力，从而判断其是否适合用于室内试验中的定殖和生物防治需求。

1.2.3 GFP标记菌定殖能力的测定

（1）GFP标记菌在烟草上定殖能力的测定

选取长势一致的烟苗，移栽到装有未灭菌自然土的花盆中，每株幼苗接种20 mL 1.00×107CFU/mL的YN42-GFP菌液于根围，以清水为对照，每处理重复20次。分别于处理后第1、10、50天取烟草根、茎、叶等组织，用无菌水冲洗4次，研磨后稀释成不同浓度，静置3 min，取150 μL汁液涂于含20 μg/mL卡那霉素的LB平板上，30℃下黑暗培养48 h，在紫外投射仪照射下统计平板上发绿色荧光的菌落数（见公式(1)），以确定菌株在烟草植株体内的定殖情况。在处理后第10天，切取无菌水清洗过的烟草根、茎组织，压片法制片，在激光共聚焦显微镜下观察YN42-GFP在烟草体内的定殖情况，以不接菌的烟草植株为对照。

（2）GFP标记菌在玉米上定殖能力的测定

按照烟草的接种方法在玉米幼苗根围接种YN42-GFP，以清水处理作对照，每处理重复20次。于处理后第1天、10天、25天测定GFP标记菌株在玉米叶片上的定殖情况，其他处理同烟草。

1.2.4 YN42对作物生长的影响

（1）对烟苗生长的影响

将YN42扩大培养后，离心去上清，以不同添加量与育苗基质混合制成微生物基质，基质处理如下：①普通基质，即基质中不加菌剂与农药，作为对照处理；②农药基质，即普通基质中含50%烯酰吗啉可湿性粉剂1500倍液；③108CFU/g菌株基质；④107CFU/g菌株基质；⑤106CFU/g菌株基质。即③、④、⑤是普通基质中分别含1.00×108、1.00×107、1.00×106CFU/g的YN42。每种处理基质播种一盘，每个处理3次重复，研究不同基质对烟苗的促生长效果。播种45天后，每处理随机取15株烟苗，测量型高（从茎基至植株最长叶片尖端间的距离）、地上部鲜重、根长和根鲜重。

（2）对玉米生长的影响

选取长势一致玉米幼苗移栽到装有未灭菌自然土的花盆中，每株幼苗接种20 mL 1.00×107CFU/mL的YN42菌液于根围，以同样浓度的LB培养基为对照，每处理15个重复，置于温室培养30天，测量玉米型高、根长、鲜重等。

2 结果与分析

2.1 YN42的GFP标记

按照Idris等[17]提供的方法，成功获得了GFP标记的菌株YN42-GFP。该菌株荧光明显，在含卡那霉素的LB平板上肉眼可见浅黄绿色菌落，在紫外投射仪下发出明亮的绿色荧光。YN42-GFP经不含卡那霉素的LB培养液连续培养5轮后涂布于不含卡那霉素的LB培养基上，随机挑取100个菌落，均可以在含卡那霉素的LB培养基中正常生长，且绿色荧光明亮，说明标记菌株质粒能稳定表达。

2.2 GFP标记菌株抑菌活性检测

在平板对峙试验中，与野生型YN42菌株相比，YN42-GFP菌株对烟草黑胫病菌、玉米穗腐病禾谷镰刀菌、水稻稻瘟病菌、番茄枯萎病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌、烟草赤星病菌、小麦雪腐病菌、苹果斑点病菌、三七根腐镰刀菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、辣椒茎腐病菌、油菜核盘病菌等13种病原真菌的拮抗能力与野生型的相同（表1）。说明标记后菌株对病原菌的抑制作用未受影响，可以替代野生型菌株，用于室内YN42生物防治和定殖研究。

图1 YN42和YN42-GFP对病原菌的抑菌作用

2.3 GFP标记菌定殖能力的测定

2.3.1 GFP标记菌在烟草植株内的定殖 GFP标记菌在烟草定殖试验中，清水对照处理所有阶段的组织涂布在含卡那霉素的LB平板上均无菌落生长，而用YN42-GFP处理后各组织涂布在含卡那霉素的LB平板上均有菌落生长。如图2-A所示，用YN42-GFP菌液处理后第1天烟草各组织菌落数量：根＞茎＞叶；随着时间的延长，茎部的菌落逐渐降低，叶片上的菌落呈现先增后减，根部的菌落变化幅度较小。到第50天时，烟草根、茎和叶组织中仍回收到1.89×106CFU/g、1.07×104CFU/g和0.93×103CFU/g的菌落，且各组织回收到的YN42-GFP在紫外投射仪下绿色荧光依旧明显，说明GFP标记菌株YN42-GFP比较稳定。移栽后的第10天，在激光共聚焦显微镜下，与对照烟草根系中微弱的自发荧光相比，经过YN42-GFP处理的根表呈现出的绿色荧光更加强烈（图2-D和图2-E）；在茎组织切片中YN42-GFP主要聚集在茎的表皮和皮层部位，维管束上也有标记菌株（图2-B和图2-C）。烟草组织中标记菌落的回收结果和荧光显微镜观察结果都表明，YN42-GFP能够进入烟草植株内部，并在烟草体内传导。

图2 标记菌YN42-GFP在烟草植株内的定殖动态和部位

2.3.2 GFP标记菌在玉米植株内的定殖 玉米通过灌根处理后能在叶片上回收到GFP标记菌落，表明标记菌株能够进入玉米植株内部，并在玉米体内传导。在灌根处理后第1天、10天、25天玉米叶片中回收的GFP菌落分别为2.22×104CFU/g、2.00×105CFU/g、6.67×103CFU/g，表明玉米叶片内的GFP菌落呈现先增后减。在激光共聚焦显微镜下可观察到经过YN42-GFP处理的根表呈现出的绿色荧光更加强烈(图3A和图3B)；在茎组织切片中YN42-GFP主要聚集在茎的表皮和皮层部位，维管束上也有标记菌株（图3C、D、E、F）。因此YN42-GFP能够很好的在玉米上传导和定殖。

图3 标记菌YN42-GFP在玉米植株内的定殖部位

2.4 对作物生长的影响

2.4.1 对烟苗生长的影响 在育苗过程中，不同育苗基质对烟苗生长的影响差异显著（表2），各处理烟苗的平均单株型高、地上部鲜重性状都显著高于对照处理。在1.00×107CFU/g的菌株基质中烟草幼苗平均单株型高、地上部鲜重、根鲜重均最高。与普通基质对照处理相比，1.00×107CFU/g菌株基质中生长的幼苗单株平均型高、根长、地上部鲜重、根鲜重分别增长450.58%、34.11%、756.52%、468.42%；与50% 烯酰吗啉可湿性粉剂1500倍液处理的基质相比，1.00×107CFU/g菌株基质中生长的幼苗单株平均型高、地上部鲜重、根鲜重分别增长138.23%、104.36%、25.58%。而1.00×108CFU/g的菌株基质中烟草幼苗的根长小于普通基质中的幼苗根长，可能是因为菌株浓度过高抑制了根的生长，导致处理烟苗的地上部生长也受到抑制，说明适宜浓度的菌株基质对烟草幼苗的生长有促进作用，YN42有开发为功能性肥料的潜力。

表2 YN42对烟苗生长效果评价

2.4.2 对玉米生长的影响 玉米幼苗经YN42菌液处理30天后，平均型高、根长、鲜重等性状都显著高于对照（表3），玉米长势更粗壮（图4）。与LB对照相比，经YN42处理后玉米型高增加19.37%，根长增长52.04%，鲜重增加61.42%。表明YN42能促进非来源植物玉米生长。

表3 YN42促进玉米生长的效果

图4 YN42处理的玉米幼苗

3 讨论与结论

内生菌在植株体内有效定殖是其发挥防病和促生作用的前提与关键因素[18]。GFP标记技术能够实时、动态地研究微生物的空间定位、微生物与环境及宿主之间的互作[19]，被作为标记物广泛应用于分子生物学和细胞生物学研究中，但GFP在菌体内的高效表达会赋予转化菌株额外的代谢负担，可能影响其生理代谢活动和生物学功能[20]。本研究中标记菌株YN42-GFP与野生菌株YN42的抑菌活性无明显差异，说明GFP蛋白表达并未对YN42的生防功能产生明显的影响。拮抗菌株抑菌谱的大小是衡量其生防价值的指标之一，YN42对13种病原真菌的平板抑菌活性试验表明其具有很好的生防潜力，但其抑菌机制还有待进一步研究。YN42菌株的成功标记为研究其在植物体内的定殖情况奠定了良好的基础，用YN42-GFP菌液对烟草和玉米进行灌根处理后在烟草和玉米叶片中均能得到回收，表明该YN42能通过根部进入寄主和非来源植物内部，并在植物体内传导。在测定时间内烟草各组织菌落数量分布为根＞茎＞叶，到第50天时，烟草根、茎和叶组织中回收到1.89×106CFU/g、1.07×104CFU/g和0.93×103CFU/g的菌落，高于烟草内生细菌YN2014048的GFP标记菌在烟草上定殖测定时第50天烟草根、茎和叶组织中回收到2.53×105、4.10×102和4.44×102cfu/g的菌落[14]，说明不同菌株的定殖能力不同。从菌落的回收情况看，烟草根部菌落一直高于茎和叶，且茎、叶组织内的菌落随着培养时间的延长降低，根部的标记菌落数量相对稳定，说明菌株在定殖位点选择上有偏好性，这与Gao等[21]在番茄上的研究一致。

植物有益内生细菌作为潜在的生防资源，已成为近年来生防菌剂和微生物肥料的热点。其中解淀粉芽孢杆菌具有较好的抗逆性、定殖能力强、对自然环境安全、次生代谢产物多样、抑菌谱广、易于商品化，是开发生防菌剂的宝贵资源[22]。Chowdhury等[23]证明喷施解淀粉芽孢杆菌菌剂后几乎不会影响根际土壤中微生物群落组成；解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2能防治多种病害，且对多种作物生长有良好的促进作用[24-25]；解淀粉芽孢杆菌YN48对烟草黑胫病有很好的防病作用[14]，能与不同含水量的漂浮基质混合制成微生物功能基质，促进烟苗生长[7]。前期研究表明YN42对白菜、番茄和油菜等多种作物有显著促生作用[16]。本研究对非来源植物玉米灌根处理，它对玉米幼苗也有显著促生效果。将YN42添加到普通基质，在育苗中使用1.00×107CFU/g的YN42菌株基质对烟苗的生长有非常显著的促生长作用，与普通基质处理相比烟苗平均型高、地上部鲜重相比分别增长450.58%、756.52%；与农药50%烯酰吗啉可湿性粉剂1500倍液基质处理相比，烟苗平均型高、地上部鲜重分别增长138.23%、104.36%。普通基质培育的烟苗长势较差，可能是因为普通基质贮藏时间偏长，其内有对烟草生长不利的病菌，影响烟苗生长，而YN42和杀菌剂具有杀菌活性，从而使得效果更明显。因此在育苗基质中加入适宜浓度的YN42有助于提高肥效、减少化学肥料的使用量，但其促生长机制以及菌株在基质中的存活时间等还有待进一步研究。

本研究成功获得质粒稳定遗传的YN42的GFP标记菌株YN42-GFP，通过平板对峙试验证明其对13种病原真菌的拮抗能力与野生型菌株相同。用YN42-GFP菌液浇灌烟草和玉米，在烟草和玉米中均能得到回收；激光共聚焦显微镜观察显示，烟草和玉米的根表、茎的表皮和皮层部位、维管束上都有YN42-GFP聚集，表明YN42在寄主植物和非来源植物上都能很好的定殖。在烟草育苗中使用1.00×107CFU/g的YN42菌株基质对烟苗的生长有非常显著的促生长作用，浇灌非来源植物玉米亦显著促进玉米苗生长。总之，烟草内生细菌YN42抑菌作用强，可在烟草和玉米体内有效定殖并对烟草和玉米有明显促生作用，为进一步将该菌株开发成生防菌剂和微生物肥料提供了实验依据。