Chlorella vulgar HDA04生长条件的初步确立

黄蒙蒙，何剑波，石会玲，凌宏志，葛菁萍

（黑龙江大学生命科学学院，微生物省高校重点实验室，哈尔滨150080）

0 引言

随着石化资源短缺问题的日益加剧，开发可再生和清洁的能源已经成为当今世界的研究热点[1]。生物柴油作为一种低成本且环境友好的新型燃料，其传统生产主要以动、植物源油脂为原料，经转酯得到长链脂肪酸酯[2]。这些原料由于其自身特点产量受限，生长周期长，影响粮食安全从而限制了生物柴油的广泛应用[3]。可产油的植物或动物本身必须提供大多数的能量以维持其低含油率纤维组织的生长，而微藻作为新一代生物质原料，能量几乎都能作为生物柴油生产的原料，其转化效率更高，有望降低发展生物柴油粮食安全的风险[4]。目前，利用微藻油脂生产生物柴油已成为能源研究领域的热点。美国绿色能源科技公司已经尝试利用废弃的CO2生产微藻，占地1 km2的养藻场一年可以处理5万t CO2[5]。

小球藻是近几年国内外大力培育和发展生物柴油新能源与固碳产业的主要藻种之一[6]，在化妆品和药品及食品添加剂多个方面都具有广泛的应用前景[7-8]。尽管小球藻在应用方面有许多优势，但将小球藻从小规模培养到投入商业化生产仍然有一些问题亟待解决，如小球藻易受水中杂菌和生长环境影响，致其生物量和产油量不能达到理想要求。王雪青等[9]在进行微藻培养时发现，微藻的纯种培养和保存是其应用的基础和关键性环节。王悠等[10]对无菌化处理前与处理后微藻生长特性的变化进行了研究，结果表明除菌后的强壮前沟藻和青岛大扁藻不易老化，可保持良好的悬浮状态。因此无菌化处理和培养基优化是小球藻研究者的必备工作[11]。培育生长速度快与油脂产率高的优良藻种，也是微藻生物柴油发展的重点[12]。

综上所述，限制小球藻产业化进程的主要原因就是细胞生长密度和脂质含量不足等问题[13]。这些问题的解决，一方面需要各环节技术的突破，另一方面也要依赖于合适的无菌化处理及培养基的优化[14]。C.vulgar HDA04分离自黑龙江省肇东盐碱地湖泊地区，具有生长速率快且含油量高的优点。本文以该藻株作为出发藻株，考察了不同抗生素对C.vulgar HDA04生物量和油脂积累的影响，并对藻株的培养条件进行单因素优化。

1 材料与方法

1.1 供试藻株及培养方法

小球藻(Chorella vulgar)HDA04由黑龙江大学微生物重点实验室提供。所用培养基为BG11液体培养基。选取长势良好的单藻落接入培养基中，显微镜下观察藻细胞悬浮液，重复稀释至得到单一藻细胞。纯化后转移至BG11培养基中进行异养培养[15]。

1.2 C.vulgar HDA04生长曲线的测定

取培养到不同时间的C.vulgar HDA04藻液8 mL，在680 nm波长下测定其吸光度，可以用来比较藻株的生长情况[16]。

取培养到不同时间的C.vulgar HDA04藻悬液8 mL，低温离心15 min(4℃，5000 r/min)后去上清，用ddH2O洗涤2次后置于烘箱中烘干并称重，用减重法计算其生物量(g/L)。

1.3 C.vulgar HDA04相对荧光强度的测定

由于C.vulgar HDA04细胞壁较厚，因此采用优化后的尼罗红染色方法检测C.vulgar HDA04细胞的相对荧光强度并以此指征其相对含油量[17-18]。

1.4 C.vulgar HDA04对抗生素敏感性的测定

藻株在培养过程中，容易受到共生细菌的污染。本实验选用不同浓度卡那霉素(10、25、50、75、100 mg/L)、四环素(10、25、75、100 mg/L)以及青霉素(0.5、1、2、5、10 mg/L)，分别接种到微藻培养液中，以不添加任何抗生素作为对照（每隔1天测定C.vulgar HDA04吸光度和细胞数以及含油量）。以生长曲线、生物量和含油量作为标准，确定最适宜的抗生素及其浓度。

1.5 对C.vulgar HDA04单因素条件优化

本实验以C.vulgar HDA04达到稳定期（第7天）为发酵终止点，发酵终止时的生物量(g/L)和相对荧光强度为检测指标，保持其他培养条件不变，分别考察氯化钠浓度(0、2、4、6、8、10、15 g/L)和蛋白胨浓度(0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 g/L)对C.vulgar HDA04生长及相对含油量的影响。

2 结果与分析

2.1 C.vulgar HDA04藻株的形态特征及生长曲线

C.vulgar HDA04从肇东盐碱湖采样分离并经过鉴定得到。如图1所示，在光学显微镜下，C.vulgar HDA04细胞多呈深绿色圆形单细胞，细胞直径3～8μm，可以自由存活，不易沉降。在没有加入抗生素的情况下，镜检时发现培养基中主要为细菌。这是由于C.vulgar HDA04藻株自身培养及纯化过程中，无法完全避免其他微生物的污染。所以考虑在培养过程中通过外源添加抗生素，来达到抑制杂菌生长的目的。

图1 C.vulgar细胞形态观察(1000X)、染菌C.vulgar HDA04(400X)

2.2 卡那霉素，四环素和青霉素对小球藻HDA04生长的影响

向培养基中添加各浓度卡那霉素，菌株生长曲线如图2所示。OD值代表细胞密度，取样间隔为1天。所有组生长趋势相同，均呈现S形生长模式。随着卡那霉素浓度的增加，C.vulgar HDA04的对数期不断缩短，在所设实验组中，只有10 mg/L实验组对其生长有促进作用，其OD值在第6天时达到最大值7.30±0.17，较对照组提高14.4%。图中还可看出，卡那霉素浓度过高，使C.vulgar HDA04的延滞期增长，生长受到影响。

图2 不同浓度卡那霉素对C.vulgar HDA04藻液光密度的影响

在所有四环素实验组中，细胞密度与添加四环素浓度呈负相关趋势（图3）。在所有实验组中，10 mg/L实验组显示的OD值最高，为5.81±0.07，较对照组(6.38±0.15)仍降低8.9%。当四环素浓度大于50 mg/L时，生长曲线不显示正常小球藻的S型生长模式，由此推测，C.vulgarHDA04的大部分细胞均失活。

图3 不同浓度四环素对C.vulgar HDA04藻液光密度的影响

与四环素实验组不同，青霉素实验组浓度与OD值非负相关（图4）。当青霉素浓度为1.0 mg/L时，OD值最高达到6.60±0.19，较对照组提高了3.4%。从图还可推测，青霉素浓度过高大于2.0 mg/L时，C.vulgarHDA04的生长受到抑制。

图4 不同浓度青霉素对C.vulgar HDA04藻液光密度的影响

2.3 卡那霉素，四环素和青霉素对小球藻HDA04生物量及含油量的影响

添加不同浓度卡那霉素，四环素和青霉素，C.vulgarHDA04的生物量和相对含油量见图5～图7。图中柱式表示生物量，线式表示相对含油量。在本实验所设的浓度梯度中，卡那霉素10 mg/L实验组，四环素10 mg/L实验组和青霉素1 mg/L实验组的数值较为理想。卡那霉素（图5）10 mg/L实验组的生物量和相对含油量较对照组的生物量(2.31±0.12 g/L)和相对含油量(3.41±0.08)分别提高15.2%和100.3%。

图5 不同浓度卡那霉素对C.vulgar HDA04生物量和相对含油量的影响（7天）

在四环素实验组中（图6），10 mg/L实验组的生物量最高达到2.18±0.13 g/L，但与对照组相比，生物量仍下降5.6%。相对含油量也在10 mg/L实验组显示最大值，较对照组提高68.3%。当添加四环素浓度大于10 mg/L，藻株生物量和相对含油量均降低。由此可作出合理推测，即四环素对C.vulgarHDA04的生长有一定的抑制作用。这可能是由于四环素类抗生素能够抑制小球藻蛋白质的合成[11]，降低藻细胞的活性，使其不能正常生长，但对单位油脂积累无影响。

图6 不同浓度四环素对C.vulgar HDA04生物量和相对含油量的影响（7天）

由图7可知，青霉素浓度在0.5～1.0 mg/L内可明显提高小球藻细胞的含油量。在所设实验组中，1.0 mg/L实验组的生物量和相对含油量最高，较对照组分别提高了13.8%和138.12%，相对含油量较卡那霉素10 mg/L实验组高37.9%。低浓度的四环素虽然可以提高C.vulgarHDA04的相对含油量，但会抑制菌株生长，使其总脂含量降低，因此不能选择四环素。青霉素1.0 mg/L实验组和卡那霉素10 mg/L实验组均对藻株生长和含油量有促进作用，尽管青霉素1.0 mg/L实验组的生物量较卡那霉素10 mg/L实验组低1.4%，但综合性价比和总产脂量分析，本实验选择1.0 mg/L的青霉素作为最佳添加抗生素。

图7 不同浓度青霉素对C.vulgar HDA04生物量和含油量的影响（7天）

2.5 C.vulgar HDA04发酵条件的优化

由于C.vulgarHDA04是在肇东市盐碱湖地区采样收集得到，所以对于氯化钠的需求含量较其他藻株要高。由图8可知，C.vulgarHDA04生物量随着氯化钠浓度增加呈现先上升后下降的趋势，与相对含油量趋势一致。当氯化钠浓度为8g/L时，藻株生物量和含油量达到最大，分别达到3.64±0.14 g/L和19.60±0.06，较对照组提高55.3%和474.8%。在浓度大于8 g/L后，生物量和含油量有明显下降的趋势，当氯化钠浓度为15 g/L时，C.vulgarHDA04的生物量下降至对照组的55.3%左右。说明氯化钠浓度过高，菌株生长受到抑制。

图8 不同浓度氯化钠对C.vulgar HDA04生物量和相对含油量的影响（7天）

氮是微藻细胞培养的必需营养物质，是细胞内蛋白质和核酸等活性物质的重要组成成分。不同蛋白胨浓度下C.vulgarHDA04的生物量和相对含油量见图9。蛋白胨实验组与氯化钠实验组走向相似，呈现先上升后下降的趋势。当蛋白胨浓度为1.5 g/L时，C.vulgarHDA04的生物量和相对含油量最高，分别达到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13，较对照组提高111%和692.3%。上述结果表明，以生物量和相对含油量为标准，氯化钠浓度8 g/L，蛋白胨浓度1.5 g/L为最优添加浓度。

图9 不同浓度蛋白胨对C.vulgar HDA04生物量和相对含油量的影响（7天）

3 讨论

本研究所用藻株是从肇东盐碱湖采样分离并经过鉴定得到。从肇东湖泊中筛选微藻菌株的一个优势是，本地分离的菌株能更好地适应室外环境的培养条件，从而增加了当地室外规模化养殖成功的机会[19]。C.vulgarHDA04生长速度快，脂肪含量高，是从分离的几株藻株中筛选出的可进一步研究的菌株。在对C.vulgarHDA04进行镜检时发现有杂菌，是由于在异养条件下，与微藻共生的细菌将利用人为添加的有机营养物质进行大量繁殖[20]。一方面，它们与微藻形成营养竞争关系，另一方面，它们的代谢产物可能对微藻具有抑制或杀伤作用，从而影响微藻的生长效率，甚至使其不能生长繁殖。因此需要做无菌化处理。但是，常规的无菌化处理方法往往使藻种纯化工作难以进行，而且藻种的纯化与纯化技术及研究经验相关。由于微藻和细菌对抗生素的敏感性有很大不同，可以利用抗生素对菌株进行无菌化处理[21]。王铃玲等[22]研究表明，适量氨苄青霉素、头孢呋辛和庆大霉素联合使用，可实现盐藻藻株的无菌化处理，郑凌凌等[23]研究表明，低质量浓度的卡那霉素、庆大霉素、链霉素对雨生红球藻FACHB-712藻株的细菌具有明显的抑制作用。

本试验选取了卡那霉素、四环素以及青霉素3种抗生素，通过浓度梯度试验研究抗生素对C.vulgar HDA04生长及相对含油量的影响。试验结果显示，适宜浓度的卡那霉素和青霉素均能促进小球藻生长。但考虑到工业大规模生产微藻时成本问题，且总产脂量近乎相等，所以本实验最终选择青霉素。在BG11异养培养基中加入浓度为1.0 mg/L的青霉素后，C.vulgar HDA04生物量和相对含油量最高达到2.63±0.03 g/L和7.77±0.16，与未添加抗生素(2.31±0.12 g/L、3.41±0.08)相比，生物量和相对含油量分别提高了13.9%和128.9%。低浓度的青霉素能够促进微藻的生长，姜思等[24]曾在2016年进行抗生素对莱茵衣藻生长及光化学影响的研究时发现，低于100 μg/mL的氨苄青霉素处理会使莱茵衣藻的细胞密度增加。郑凌凌等[23]发现低质量浓度的氨苄青霉素对雨生红球藻FACHB-712的生长起促进作用，陈淑吟等[25]研究发现，青霉素浓度为0.5～1.0 mg/L时有利于异胶藻(Heterogloea sp.)的培养和保存且效果较好，但青霉素浓度≥2.0 mg/L对三角褐指藻(P.ricornurum)的生长有明显的抑制作用，这与本试验的结论基本相符。但由于不同微藻对抗生素的敏感性以及藻液中细菌群落结构特征影响不同，所以要慎重选择抗生素。

微藻培养条件优化与探索，是实现其快速生长和脂肪酸产量提升的重要手段。C.vulgar HDA04是从盐碱湖分离得到，所以盐度需求较其他藻株要高。冯倩等[26]研究表明，盐度对藻类脂肪酸的积累有不同程度的影响，提高氯化钠浓度可以促进微藻脂肪酸的积累，但不利于生物量增加，说明盐度胁迫导致的渗透压变化对细胞吸收营养物质和胞内生化反应产生影响，不利于细胞增长繁殖，但可促使细胞积累脂肪酸。这与本研究结果大致相符，即高浓度的氯化钠对生物量有明显抑制作用，对相对含油量无太大影响。藻类对氮元素的吸收会引起培养基pH的变化，继而会影响细菌新陈代谢，所以选择BG11培养基中唯一氮源-蛋白胨为研究对象，探究C.vulgar HDA04生长的最适蛋白胨浓度。当添加氯化钠浓度8 g/L和蛋白胨浓度1.5 g/L时，C.vulgar HDA04的生物量和相对含油量水平最高达到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13，较对照组提高111%和692.3%。本研究仅对C.vulgar HDA04的抗生素敏感性和发酵条件进行了较为基础的研究，后续还需要探究C.vulgar HDA04生长速率与脂质积累之间的关系，制定出藻株脂质合成过程中参数的最优控制策略。

4 结论

本试验以实验室自存的小球藻(Chlorella vulgaris)HDA04作为出发藻株，利用抗生素对C.vulgar HDA04进行分离纯化，以此为基础，对C.vulgar HDA04培养基成分进行了优化。在摇瓶水平下，青霉素浓度为1.0 mg/L，氯化钠浓度为8 g/L、蛋白胨浓度为1.5 g/L时，C.vulgar HDA04的生物量和相对含油量最高，分别达到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13。