拉曼光谱法分析与鉴别不同精炼程度的石蜡

张书迪，方巧灵，陈芳芳，庞海月，陈川，叶廷秀，张伯超，王贵弘

（厦门医学院 天然化妆品福建省高校工程研究中心，福建厦门 361023）

石蜡是我国重要的工业原料之一，广泛用于造纸、食品、蜡烛、包装、冶金、电子等领域。石蜡主要由直链烷烃构成，将原油蒸馏后的润滑油馏分经过诸如冷榨、发汗、白土吸附、溶剂脱蜡、溶剂喷雾脱油、加氢精制等加工过程而得［1］。精制加工的主要作用是去除原料中的硫、氮、氧等非烃类杂质，脱油，将不饱和烃加氢还原等［1–2］。根据加工精制程度的不同，石蜡可分为粗石蜡、半精炼石蜡和全精炼石蜡。3 种石蜡的正构／异构／环烷烃含量、碳分布、含油量等化学组成不同，用途各异［3–4］。由于含油量较高，粗石蜡的主要用途为制造火柴、纤维板、蓬帆布等；半精炼石蜡和全精炼石蜡更加纯净，主要用于食药品生产与包装、容器表面涂料、瓜果蔬菜保鲜、电器元件绝缘、提高橡胶抗老化性和柔韧性等，因此精炼石蜡的用途更加广泛［5］。

据报道，市场上半精炼石蜡的售价要比粗石蜡高出约300 元／吨，而全精炼石蜡的价格则更高［6］。3 种石蜡均为白色固体，无法从外表对其进行准确鉴别。一般根据石蜡化学组成成分的不同，可以使用气相色谱法进行分析，但该法需要将样品进行溶解后上机分析，较为费时费力；根据石蜡物理微观结构的不同，可用X 射线衍射、光学／电子显微镜观察晶体结构的差异，但晶体结构较为复杂，利用上述方法不能很好地对精炼程度不同的石蜡进行特异性鉴别［3–4］。拉曼光谱法是通过测量化学物质对入射光的非弹性散射造成光子能量的变化程度，从而测量对应化合物含量的一种分析方法。与上述几种方法相比，拉曼光谱法具有快速、简便、非破坏性、原位分析性等优良特性［7］，尤其适合分析不易进行样品前处理的固体样品，因此被广泛用于许多领域，如珠宝玉石中石蜡填充物的分析鉴定［8–9］、大米中石蜡掺杂物的分析鉴别［10］、水果表皮人工石蜡层的分析鉴别［11］、蜂蜡中非法石蜡添加物的分析鉴定［12］等。虽然拉曼光谱法在石蜡的检测中已有较多应用，但目前并没有采用该技术分析与鉴别不同精练程度石蜡的报道。笔者采用拉曼光谱法对16 种不同精练程度的石蜡样品进行分析，考察不同激光波长对拉曼信号的影响，并用化学计量学方法进行建模分析，以期达到有效鉴别的目的。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

激光共聚焦显微拉曼光谱仪：DXR3 型，配有聚苯乙烯球标准样品，美国赛默飞世尔公司。

石蜡样品：共16 份，精炼程度不同，信息见表1。其中13 份作为化学计量学模型训练集（编号以P 开头），3 份作为模型验证集（编号以T 开头）。

表1 石蜡样品信息

1.2 实验方法

在分析样品前，使用聚苯乙烯球标准样品对仪器进行自动化校准与调谐（包括激光聚焦位置、拉曼位移值校准等）。校准完毕后，从每种样品中随机抽取3 个颗粒放在载玻片上，然后将载玻片置于仪器检测台上。将视野及激光聚焦至样品表面后，按照表2 仪器工作条件对样品颗粒进行分析，在每个颗粒上采集来自3 个不同点的拉曼谱图，记录并保存获得的数据。

表2 拉曼光谱仪工作条件

1.3 数据处理

从每份样品中各取3 个颗粒，每个颗粒选择3个分析点位，因此每份样品共得到的谱图数量为9个。利用自行编写的Labview 程序（实验室虚拟仪器工程工作台），分别将每份样品的9 个谱图进行平均处理，然后采集处理后谱图的峰位置与峰面积等信息，并将所有样品峰信息整合成一个综合数据表格，以备进行化学计量学处理。

1.4 化学计量学处理

将1.3 整理完成的数据表格导入SIMCA 软件（多元变量统计分析软件）中，将数据按照单位方差法（UV）进行归一化处理，再进行化学计量学建模分析，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS）。其中，P1～P13 样品的数据作为训练集构建模型，T1～T3 样品的数据作为验证集验证模型的预测能力。

2 结果与讨论

2.1 不同激光波长下石蜡样品的拉曼光谱

图1 不同激光波长下P1、P8、P13 样品的拉曼光谱图

分别在532 nm 和633 nm 激光照射下，16 份石蜡样品共有31 个拉曼光谱峰被检出，波数最小的谱峰为77 cm–1，波数最大的谱峰为2 956 cm–1。信号最强的谱峰为2 848 cm–1。图1 为P1、P8 和P13 样品分别在532 nm 和633 nm 激光照射下的拉曼光谱图，它们分别代表全精炼石蜡、半精炼石蜡和粗石蜡。为了展示信号强度小的谱峰，图1（B）和图1（D）的信号强度展示范围调为0～300 cps；另外，为了对比不同激光波长的结果，图1（A）与图1（C）、图1（B）和图1（D）的信号展示范围调为一致。不同样品拉曼光谱的对比结果表明，全精炼石蜡、半精炼石蜡及粗石蜡在两种波长下的谱图形状均非常相似，无法用肉眼直接区分；而不同激光波长下样品的拉曼光谱图表明，3 种样品大部分拉曼谱峰在633 nm 下的强度比在532 nm 下的强度低很多，但也有个别例外，如1 061 cm–1谱峰的信号在两种波长下变化不大，这说明不同的激光波长对石蜡样品中各种化学物质有着不同的作用结果。因为单纯从含有大量数据的表格和谱图上难以对各样品的所有谱峰进行细致的对比，所以需要进一步用统计学方法将不同组别样品的特征差异信号进行提取。

2.2 不同波长激光下样品信号差异分析

为了考察不同波长的激光对样品拉曼信号的具体影响，采用化学计量学工具找出差异显著的拉曼谱峰，并将样品进行归类。首先将所有谱峰信号作为自变量（X）进行主成分分析，结果如图2（A）所示。主成分分析是一种统计学方法，它可将原有的多个自变量通过数学处理降维成含有最丰富信息的2 个新变量（t1和t2），从而达到去除冗余信息、浓缩有用信息的效果，而这些新变量就是所谓的“主成分”［13］。对每个样品的主成分值作图，可得到如图2（A）所示的PCA 得分图，同一性质的样品点相互聚集的趋势明显，则可认为模型可准确地对样品进行分类。从图中可以看出，532 nm 与633 nm的样品点有较为明显的对半分布趋势，再次说明激光波长对石蜡拉曼光谱信号具有很明显的差异化作用。但在中间的交界处仍存在一些互相混合的现象，因此将模型换成PLS 再进行分析。PLS 是一种有监督的学习方法，它除了将谱峰信号作为自变量外，还引入了因变量（Y）的概念，将532 nm 波长下所有样品的因变量设为“1”，633 nm 波长下样品的因变量设为“2”，在信息提取时需要同时考虑X和Y的信息最大化，因此可以将分类做得更好［14］。如图2（B）所示，两种波长激光下的点互相分离、聚集较好，未出现图2（A）中部分互相交融的现象。

图2 13 个训练集样品数据的PCA 及PLS 分析结果

为了确保模型未过拟合，对该PLS 模型进行响应排序验证（PMT），结果如图3（A）所示。由图3（A）可知，Q2的最右边的值比左边其它值高，且回归曲线在纵轴上的截距（–0.318）小于0，表明该模型结果优良，未出现过拟合现象［15］。在PLS 模型中，还可进行变量投影重要性（VIP）分析，该分析对所有X的信息贡献度以及其与Y的关联度进行评估，数值越高，该变量对模型分类的贡献度越大［16］。本节PLS 模型的VIP 分析结果如图3（B）所示。由图3（B）可知，贡献最大的变量为1 417 cm–1，表明它在两种激光作用下信号强度变化最大；VIP 值最小的变量为844 cm–1，表明它在两种激光作用下信号的强度变化最小。

图3 PLS 模型的响应排序验证（PMT）与变量投影重要性（VIP）结果

表3 列出了VIP 的最大值（1 417、2 956、2 895 cm–1）以及最小值（845、414、364 cm–1）的峰信息各3 个，可进一步验证前3 个峰在不同激光波长下的信号变化较为明显，而后3 个峰的信号变化可忽略不计。通过查阅文献可知，前3 个峰分别代表—CH2的变形振动、CH3的对称伸缩振动、CH2的非对称伸缩振动，后3 个峰分别代表C—C 键的伸缩振动和C—C—C 键的变形振动。该结果说明不同激光波长对C—H 的振动影响较大，对C—C 键的振动影响较小。

表3 不同激光波长下6 个峰的峰面积

图4 在不同波长激光下13 个训练集样品按全精炼、半精炼及粗石蜡分组的PCA 及PLS 结果

2.3 用化学计量学方法鉴别不同精炼程度的石蜡

为了探索化学计量学方法对不同精炼程度石蜡样品的鉴别能力，按照全精炼石蜡、半精炼石蜡和粗石蜡对所有石蜡数据进行分组，在532 nm 和633 nm 下分别进行PCA 以及PLS 分析，结果如图4 所示。从图4 中可以看出，不论是在不同波长的激光作用下，还是用不同的化学计量学模型进行分析，均无法对全精炼石蜡、半精炼石蜡和粗石蜡进行很好地分类。尤其是半精炼石蜡和全精炼石蜡混合在一起无法区分。因此放弃区分半精炼及全精炼石蜡，将这两种样品统一合并成“精炼石蜡”一类，并重新进行PCA 以及PLS 分析。

在532 nm 和633 nm 两种不同波长的激光作用下，分别对按照精炼石蜡、粗石蜡分组的13 个训练集样品和3 个测试集样品（T1 代表全精炼石蜡、T2代表半精炼石蜡、T3 代表粗石蜡）进行测定，PCA及PLS 分析结果如图5 所示。从图5（C）和图5（D）中可以看出，在633 nm 激光作用下，无论是PCA 模型还是PLS 模型均无法将粗石蜡从精炼石蜡中鉴别出来，它们在图上的点非常接近，甚至互相混合。然而在532 nm 激光作用下即图5（A）和图5（B），粗石蜡和精炼石蜡在图上的点有较为明显的差别，尤其是在PLS 模型中，粗石蜡的聚集区域与精炼石蜡的聚集区域得到了很好地分离，这说明样品得到了很好的分类。

为了验证该PLS 模型的预测能力，分别将T1、T2 以及T3 测试集样品的谱峰数据代入已经生成的532 nm–PLS 模型中进行预测，结果如图5（B）所示。由图5（B）可以看出，T1 和T2 测试集样品在图上的点落在了精炼石蜡的聚集圈中，而T3 测试集样品在图上的点落在了粗石蜡的聚集圈中，预测准确率达到100%，表明在532 nm 激光作用下，采用PLS 模型可以对精炼石蜡以及粗石蜡样品进行准确的鉴别。

图5 在不同波长激光下13 个训练集样品按精炼石蜡、粗石蜡分组以及3 个测试集样品的PCA 及PLS 结果

为验证上述532 nm–PLS 模型的可靠性，对其进行PMT 分析，结果见图6。由图6 可知，Q2最右点的值大于所有位于左边点的值，且回归曲线在纵坐标上的截距小于0（–0.318），该模型未过拟合，可靠性强。对该模型进行VIP 分析，结果见图7。由图7 可知，贡献最大的变量为2 429.24 cm–1，表明它的信号强度变化最大；VIP 值最小的变量为227.468 cm–1，表明它的强度变化最小。

图6 PLS 模型的响应排序验证（PMT）结果

图7 PLS 模型的变量投影（VIP）重要性结果

VIP 值越大，该变量对模型的贡献程度越高，代表该谱峰作为区别不同精炼程度石蜡的标志物的可能性越大。一般选择VIP 值大于1 且置信区间（在图中以误差条形式给出）不超过VIP 值的变量作为合格的标志物［16］。根据此标准，筛选出5 个标志物，分 别 为2 429、414、873、1 062、386 cm–1，其 中414、873、1 062 cm–1分别对应于C—C—O 的变形振动、C—O—C 的变形振动及C—O 的变形振动。以上结果说明粗石蜡与精炼石蜡的区别很大程度在于醚、酮类含氧物质的含量或形态的不同，这与石蜡在精制加工过程中发生的化学变化息息相关。

3 结论

（1）获得了石蜡样品在不同激光波长下的拉曼谱图及其具体谱峰信号数据。

（2）用化学计量学方法分析了不同激光波长对石蜡样品中化学键的差异化影响程度，发现C—H键对激光波长的反应最敏感，C—C 键最不敏感。

（3）开发了偏最小二乘分析模型，在532 nm 波长激发下成功预测了精炼石蜡与粗石蜡样品，并根据模型参数分析得出造成不同精炼石蜡差异的因素之一为醚、酮类含氧物质的差异。