某猪场苍蝇体表携带细菌情况分析

赵津，李朝，赵国洪，韩建强*

(1.玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653106； 2.云南大学实验动物中心，云南 昆明 650024)

苍蝇是重要的病媒生物，是100多种病原(细菌、病毒、寄生虫)的传播媒介，它通过机械性和生物性能传播多种病原[1]。对于养猪业来说，苍蝇不仅引起猪只烦躁不安，更重要的是传播沙门氏菌、大肠杆菌、链球菌、非洲猪瘟、猪瘟、蓝耳病、蛔虫、球虫等重要病原，给养猪业带来重大损失[2，3]。本文通过苍蝇体表细菌分离鉴定、动物感染试验，从而获悉苍蝇携带致病菌情况，为猪场苍蝇控制和疾病预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和材料

血琼脂平板购自广东环凯生物科技有限公司；胰蛋白大豆肉汤(Tryptic Soy Broth, TSB)为英国 OX-OID 公司产品；新生小牛血清购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCRmix、DL2000TM Marker均购自广州东盛生物科技有限公司；通用引物合成和细菌16S rRNA测序由华大基因生工生物工程(上海)股份有限公司完成；其他化学试剂均为国产分析纯产品。25只昆明小鼠系杂交 SPF 级小鼠，购自昆明医科大学实验动物中心。

1.2 样本来源

用捕蝇器在云南某规模化猪场3个猪舍捕捉苍蝇，每个猪舍取10只放入灭菌自封袋，共30只。标记后带回实验室。

1.3 样本处理

将每组10只苍蝇放入10 mL灭菌离心管，加入2 mL灭菌生理盐水，震荡3 min，在超净工作台内分别吸取洗液100 μL，接种至血琼脂平板，用灭菌三角玻璃棒涂布均匀，置37 ℃恒温恒湿培养箱，培养24 h，挑取不同形态菌落进行分离纯化[4，5]。

1.4 染色镜检

挑取菌落进行革兰氏染色，然后于显微镜下观察细菌形态。

1.5 细菌16S rRNA测序

用细菌16S rRNA通用引物[6]扩增分离菌株的16S rRNA基因序列(见表1)，扩增产物通过琼脂糖核酸电泳检测后送上海生工测序。应用MegAlign分析软件，对分离菌株16S rRNA 序列与GenBank上公布的国内外相关菌株16S rRNA序列进行比对分析，鉴定菌株。

表1 细菌16S rRNA通用引物

1.6 动物致病性试验

将25只SPF级昆明小鼠随机分成5组，将鉴定细菌用灭菌生理盐水制备成菌悬液，试验组每只注射0.5 mL分离菌悬液，对照组每只注射0.5 mL灭菌生理盐水，连续7 d观察小鼠死亡情况，及时对死亡小鼠体内病菌进行分离鉴定。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养及革兰氏染色镜检结果

从3个猪舍苍蝇体表分离到4种不同菌落的细菌，分别标记为ZY1、ZY2、ZY3、ZY4，其中ZY1菌落表面粗糙不透明，污白色，镜检为革兰氏阳性长杆状细菌，着色均匀，无荚膜，长时间冷藏后，形成芽孢，呈椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏；ZY2菌落表面光滑，灰白色，镜检为革兰氏阳性短杆状细菌，一端或两端膨大，栅栏状或“V”字形排列，无荚膜；ZY3菌落干燥，在血平板上α溶血，镜检革兰氏染色不定，以革兰氏阴性为主，其间有少量细菌为革兰氏阳性，呈双或链状排列；ZY4菌落表面光滑、圆形、淡黄色，镜检为革兰氏阳性，成团、链或单个存在(见图1)。

ZY1 ZY2

2.2 16S rRNA序列分析

将分离的ZY1、ZY2、ZY3、ZY4菌株16S rRNA序列与NCBI数据库进行比对，同时使用DNA Star分析软件中的MegAlign分析软件，用Clustal W算法对分离的ZY1、ZY2、ZY3、ZY4菌株16S rRNA序列与GenBank上公布的国内外菌株16S rRNA序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。结果显示：ZY1分离株属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(见图2)，在进化树中与3株枯草芽孢杆菌位于同一分支，与B.subtilisHZMJW位于同一小分支；ZY2分离株属于短杆菌(Bacillusbrevis)，在进化树中与3株短杆菌位于同一分支(见图3)；ZY3分离株属于产硫球链菌(Globicatellasulfidifaciens)，在进化树中与4株产硫球链菌位于同一分支，与G.sulfidifaciensU90位于同一小分支(见图4)；ZY4分离株属于巨球菌(Megasphaera)(见图5)，在进化树中与3株犬巨球菌和1株牛巨球菌位于同一分支，与犬巨球菌M.canisSD607同源性达100%。

图 2 分离株ZY1 16S rRNA基因核苷酸序列构建系统进化树

图 3 分离株ZY2 16S rRNA基因核苷酸序列构建系统进化树

图 4 分离株ZY3 16S rRNA基因核苷酸序列构建系统进化树

图 5 分离株ZY4 16S rRNA基因核苷酸序列构建系统进化树

2.3 动物致病性试验

经动物感染试验发现：ZY1(枯草芽孢杆菌)试验组、ZY2(短杆菌)试验组、ZY3(产硫球链菌)试验组和对照组小鼠>7d，均未发现小鼠死亡或有临床症状。ZY4(巨球菌)试验组小鼠12h内死亡2只，24h内5只全部死亡，剖检死亡小鼠，发现小鼠肝、脾肿大，肠道内充满黄绿色水样内容物；用小鼠肝脏触片，革兰氏染色发现革兰氏阳性呈团、链或单个的细菌存在(图6)，从肝脏再次分离到原接种细菌。

图6 ZY4(巨球菌)试验组死亡小鼠肝脏触片革兰氏染色镜检(1000×)

3 讨论

本研究分离到4种细菌，通过16S rRNA基因序列分析法鉴定为枯草芽孢杆菌、短杆菌、产硫球链菌、巨球菌，其中，枯草芽孢杆菌为益生菌，无致病性，常作为微生物饲料添加剂使用；短杆菌属于棒状菌群，能够利用天冬氨酸合成赖氨酸、苏氨酸等，在食品、医药和畜牧业上的作用很大，在动物上未见有致病性报道；本研究小鼠试验显示，以上2种细菌无致病性。产硫球链菌属于球链菌属，是1992年 Collins等[7]提议设立的一个新菌属，目前由血球链菌和产硫球链菌2个菌种组成，产硫球链菌为革兰氏染色不定球菌，以革兰氏阴性为主，其间有少量细菌为革兰氏阳性，呈单个、成双或链状排列，仅分离于动物[8，9]，P. Vandamme等从小牛化脓感染的肺脏分离到产硫球链菌[8]，郭雅旭采用 PCR 检测方法及细菌分离鉴定的方法进行病原鉴定，结果为猪蓝耳病病毒与产硫球链菌混合感染[10]，Carlos E. C.等从母猪尿液中分离到产硫球链菌，说明产硫球链菌对动物有一定的致病性[11]。但本研究从苍蝇上分离的产硫球链菌感染小鼠试验，未导致小鼠出现症状和死亡，可能该分离菌株无致病性或其为条件致病菌。巨球菌之前属于葡萄球菌属成员[12]，因其基因组显著小于葡萄球菌而被重新划分为独立的巨球菌属[13]。它包括七个成员：M.bovicus,M.carouselicus,M.equipercicus,M.brunensis,M.hajekii,M.Lamae,M.Canis[14]。巨球菌虽然被认为是环境细菌，但是也有在动物上致病的报道，国外学者从羔羊、狗的鼻中分离到巨球菌[15，16]，Cristina M等发现巨球菌导致北极大白额雁胚胎死亡[14,17]，国内李根等报道了一株高致病多重耐药的巨球菌在商品肉鸡中暴发，引起鸡颅腔内干酪样渗出、脑炎、脑坏死以及其他器官的出血和炎症，死亡率高达25%[14]。本研究从苍蝇上分离的巨球菌与国外一株犬分离的巨球菌M.canisSD607同源性高达100%，小鼠试验显示，12h内死亡2只，24h内5只全部死亡，剖检死亡小鼠发现，小鼠肝脾肿大，肠道内充满黄绿色水样内容物，从肝脏再次分离到原接种细菌，说明其致病力较强，后续将对其毒力基因和耐药性进一步研究。

苍蝇是很多病原的传播媒介，被称为“微型细菌弹”[2]，可使疾病在猪群中传播流行，本研究分离到的4种细菌中，就有2种细菌存在对猪群致病的可能(产硫球链菌可能为条件致病菌)。因此，加强猪场灭蝇工作，对猪病防控起到至关重要的作用。