广西Tanay病毒粒子形态观察

李楠，何于雯，孟锦昕，王静林

(云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

Negevirus病毒，为单股正链RNA病毒，是新发现的昆虫特异性病毒，这类病毒可分为Nelorpivirus和Sandewavirus[1,2]两个不同的进化分支。Nelorpivirus进化分支由Negev virus(NEGV)、Loreto virus(LORV)和 Piura virus(PIUV)组成；Sandewavirus进化分支包括Santana virus(SANV)、Dezidougou virus(DEZV)、Wallerfield virus(WALV)以及相关病毒[3,4]。2014年，从菲律宾采集的蚊虫分离到4株病毒，经鉴定为Sandewavirus进化分支的一个新种病毒，Tanay病毒[5]。2013年，从广西采集的库蚊标本中再次分离获得7株Tanay-like病毒，但与菲律宾的Tanay病毒全基因组核苷酸序列存在20%左右的差异[6]，提示广西分离的病毒可能是新的Tanay病毒。本研究通过透射电子显微技术对Tanay病毒粒子的形态进行观察，以期为该病毒的基础理论研究及人或动物相关虫媒病毒病的防控研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

病毒株及细胞：GX13M50株病毒于2013年分离自广西南宁市马山县郊区采集的致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)，经分子生物学鉴定为Tanay病毒，-80 ℃冰箱保存备用；C6/36细胞由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供。

1.2 病毒复壮及培养

将培养长至单层的25 cm2大小的C6/36细胞倒去培养液，接种200 μL解冻后的GX13M50病毒液，置于28 ℃恒温箱培养吸附1 h，弃去病毒液，加入含2%胎牛血清的细胞维持液，置于28 ℃恒温培养箱继续培养，将培养2代的细胞培养物冻融3次后作为复壮后的种子病毒，取复壮后的GX13M50病毒液接种C6/36细胞，置于28 ℃恒温培养并每日观察细胞病变情况。

1.3 电镜观察

当细胞刚出现病变未脱落时，留约1 mL细胞培养液，用细胞刮将细胞轻轻刮下，1 000 r/min离心20 min,弃上清，沉淀用2.5%戊二醛置于4 ℃固定2 h，再用1%锇酸固定2 h，乙醇梯度脱水后，沉淀用环氧树脂浸渍、包埋，用超薄切片机将细胞沉淀物切成80 nm厚的超薄切片，用1%醋酸双氧铀和0.2%柠檬酸铅双重染色后用电镜观察病毒粒子。

2 结果

2.1 GX13M50感染C6/36细胞的病变观察

用复壮后的GX13M50病毒液接种C6/36细胞，接种96 h后开始产生细胞病变，其特征为细胞聚集、折光性变强、脱落(图1)。

A B

2.2 病毒粒子电镜观察

通过电镜观察可以清晰地看到，C6/36 细胞的细胞质中存在较多的子代病毒聚集，并可见成熟病毒粒子释放出胞；成熟Tanay病毒粒子呈椭圆形，直径大约为50 nm，并有一个短的突出物(图2)。

A B

3 讨论

Negevirus病毒大多分离自蚊虫、白蛉等吸血昆虫，尤其在蚊虫中有较高的感染率。蚊虫是很多致病病毒的载体，其中许多对人类及动物的健康都有相当大的影响，如登革热病毒、基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒等均可致人类严重疾病[7,8]。Negevirus病毒可以在蚊子细胞中复制，但不能在脊椎动物细胞中复制，通常不会引起宿主动物疾病[9]。有研究报道，许多经节肢动物传播的感染脊椎动物和植物的病毒最初是节肢动物病毒[10]。感染的蚊虫在吸血过程中，使病毒与脊椎动物亲密接触，从而可能增加病毒适应脊椎动物的能力并成为其病原体。此外，这些新分离的病毒地理分布和昆虫宿主范围广泛，推测很有可能会感染其他类型的昆虫；这些病毒在昆虫宿主中传播及其在自然界的循环还有待进一步研究。Negevirus病毒的进一步分离及鉴定，对了解这类病毒的地理分布、遗传进化以及蚊媒疾病的控制具有重要意义。

本研究通过C6/36细胞对广西新分离病毒GX13M50株进行复壮及培养，接种96 h后，被感染细胞出现聚集、折光性变强、脱落等明显病变特征；进一步的超薄切片电镜观察结果显示，Tanay病毒寄生在C6/36 细胞的细胞质中，利用细胞质的养分进行增殖；说明该病毒对C6/36细胞有较好的适应性。2013年Vasilakis等最早通过电镜观察发现Negev、Ngewotan、Piura、Loreto、Dezidougou和 Santana病毒粒子呈球形颗粒，直径为45～55 nm[11]。本研究中对Tanay病毒形态观察结果显示，病毒粒子为椭圆形，直径约50 nm，并具有一个短的突起；该病毒粒子具有明显的形态学特点，这与Nabeshima[5]等报道的Tanay病毒负染电镜观察结果一致。电镜观察是最常用的病原鉴定方法，可快速诊断及鉴别病毒感染，本研究有助于了解Tanay病毒的形态学特征，为该病毒的形态学诊断及进一步深入研究提供基础数据。

致谢：感谢公益性行业(农业)科研专项(201303035)在昆虫样品采集中给予的资助，感谢广西兽医研究所吴健敏教授在标本采集给予支持和帮助，感谢曹颖颖在病毒分离中给予的帮助。