紫丁香花中山奈酚-3-O-芸香糖苷的提取工艺优化及含量动态变化规律

卢洁 王线中 李晓琳康文艺崔丽丽*

1.河南大学国家食用菌加工技术研发专业中心，河南开封 475004;2.开封市保健食品功效成分研究重点实验室，河南开封 475004;3.驻马店市旭升农业科技有限公司，河南驻马店463800

紫丁香(Syringa oblataLindl.) 为木樨科(Oleace)丁香属(Syringa)落叶灌木或小乔木，又称华北紫丁香、百结等，紫丁香群体花期时间为20 d，各株间花期在10～17 d 之间，平均花期为14 d[1-2]。

目前，对紫丁香化学成分研究主要集中在国内。张树军[3-7]课题组系统地研究了紫丁香的化学成分，对紫丁香树枝、树皮、树叶、花蕾、种子以及果壳的化学成分进行了详细的研究。共分离得到50 余个化合物，主要是三萜类、苯乙醇类、环烯醚萜类和苯丙素类化合物。田雷等[8]从紫丁香叶中分离得到(+)松脂素-4″-O-β-D-葡萄吡喃糖苷等9 个化合物。周业明[9]从紫丁香叶中分离鉴定得到呋喃甲酸等11个化合物。李全等[10]从紫丁香叶中分离鉴定得到7-羟基-6-甲氧基香豆素(莨菪亭) 和芹菜素等8 个化合物。Zhao 等[11]对紫丁香叶化学成分进行研究，从中分离得到2 个新的单萜化合物:syringopicrogenin D 和syringopicrogenin E。综上所述，紫丁香非挥发性成分主要为环烯醚萜类、苯乙醇类、苯丙素类和三萜类化合物，黄酮类、有机酸类等其他成分报道的较少。

本课题组[12]前期对河南产紫丁香花化学成分进行研究，分离鉴定了15 个化合物。其中黄酮类化合物有5 个，含量较高的化合物有山奈酚-3-O 芸香糖苷、对羟基苯乙醇、芦丁、白藓苷A、熊果酸等。目前关于紫丁香花的次生代谢产物含量和动态变化研究较少。紫丁香叶的次生代谢产物含量测定和动态变化研究较多，主要涉及紫丁香苷、丁香苦苷、羟基酪醇、芦丁、原儿茶酸、原儿茶醛和酪醇[13-19]，研究表明，紫丁香叶中丁香苦苷含量较高。本研究以紫丁香花中含量较高的山奈酚-3-O 芸香糖苷(KR)为目标成分，采用超声-高相液相色谱技术(HPLC)，并结合单因素筛选、正交设计试验等方法，确定KR最优提取条件。研究不同采摘时间紫丁香花中KR的含量变化，希望对紫丁香花中KR 的开发利用提供参考。

1 材料、试剂与仪器

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(LC-20AT 液相色谱输液泵、CTO-10AS 柱温箱、SPD-20A 紫外检测器、LC-Solution 色谱数据处理系统，日本岛津);KQ-500DB 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，江苏);TGL-16 型高速离心机(江苏金坛市中大仪器厂);AB135-S 型十万级电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士);分样筛(上虞市五四仪器筛具厂，浙江);甲醇(HPLC 级，陇西科学股份有限公司);甲酸(天津市富宇精细化工有限公司);纯净水(杭州娃哈哈百利食品有限公司);山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号JOT-10763，成都普菲德生物技术有限公司)。

1.2 植物来源

紫丁香花于2019 年3 月19 日至4 月5 日采集于河南大学金明校区，由国家食用菌专业加工技术研发专业中心李昌勤教授鉴定为木樨科丁香属植物紫丁香(S.oblata)的干燥花，标本存放于河南大学国家食用菌专业加工技术研发专业中心。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取KR 适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度分别为0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、1.6 mg/mL 的标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取紫丁香花样品粉末10 mg，加入适量的提取溶液，超声提取后离心10 min，吸取上层清液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件和系统适用性实验

按照色谱条件，分别进样对照品溶液和供试品溶液。如图1 所示，在此色谱条件下，供试品溶液中KR 的色谱峰与对照品出峰时间一致，化合物分离度良好。

色谱柱:LiChrospher©100 RP-18 endcapped(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)-0.25% 甲酸水溶液(B);梯度洗脱:0～46 min，5%～42%A，95%～58%B，46～75 min，42%～60%A，58%～40%B;流速:0.8 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:254 nm;进样量:10 μL。

2.4 含量测定

取18 个不同采集时间的紫丁香花供试品溶液，按2.3 项下色谱条件依次注入HPLC 分析，按外标法计算KR 的含量。

3 结果与分析

3.1 线性关系考察

精密吸取不同浓度的对照品溶液，按2.3 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，进样质量(X，μg)为横坐标，得回归方程Y=1 000 000X-217 372。结果表明，KR 进样量分别在0.25～32 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.2 提取工艺优化-单因素试验

3.2.1 粉碎目数的选择

分别考察粉碎目数为10、30、50、70 目对KR 提取率的影响。当粉碎目数为50 目时，对KR 的提取率达到最大。因粉碎目数越大提取率越低，故选择50 目的分样筛，见图2。

图1 紫丁香花供试品（A）与对照品（B）的HPLC 图

图2 粉碎目数对紫丁香花中KR 提取率的影响

3.2.2 超声时间的选择

分别选择20、30、40、50、60 min 为超声时间，按照上述试验条件，比较不同超声时间对KR 提取率的影响，结果见图3。当超声时间为50 min 时，对KR 的提取率达到最大。之后随着时间的增加，KR的提取率呈现下降趋势。推测原因可能是由于超声过热导致部分有效成分分解[20]。因此，最佳提取时间确定为50 min。

图3 超声时间对紫丁香花中KR 提取率的影响

3.2.3 离心转速的选择

在上述优化的最佳条件下，选择1 000、4 000、7 000、10 000 r/min 考察离心转速对KR 提取率的影响，结果见图4。提取率在4 000 r/min 时达到最大，故试验选择4 000 r/min 作为正交因素水平的中心点。

图4 离心转速对紫丁香花中KR 提取率的影响

3.2.4 固液比的选择

考察固液比为1 ∶100、1 ∶120、1 ∶140、1 ∶160、1 ∶180时紫丁香花中KR 的含量，结果见图5。固液比达到1 ∶160 时，KR 提取率达到最大值;继续增加固液比例时，提取率反而有所下降。这是因为在一定范围内，溶剂量的增加使紫丁香花内有效成分与溶剂接触概率增加，有效成分溶出概率也相应增加，得率不断提高;当固液比值达到一定数值后，超声波的空化作用对植物细胞破裂辅助程度有所下降，且有效成分的溶出也接近饱和，造成提取率出现下降[21]。

3.3 提取工艺优化-正交试验

通过SPSS 19.0 设计4 因素3 水平正交实验(如表1 所示，每个因素的水平范围都是参照单因素实验的结果而定)，筛选紫丁香花中KR 的最佳提取条件。并按照表1 和表2 所设计条件制备样品，按2.3 项下色谱条件进行HPLC 分析，按照外标法计算KR 的含量。

图5 固液比对紫丁香花中KR 的影响

表1 正交试验因素和水平表

通过固液比(倍)、粉碎目数(目)、离心转速(r/min)和超声时间(min)4 因素3 水平的正交试验，发现各组合对KR 的含量影响差异性很大。由表2 所示，固液比的影响因素最大，粉碎目数次之。实验因素的主次顺序的结果为:固液比＞粉碎目数＞离心转速＞超声时间，最优组合为A3B3C2D2，即:固液比为1 ∶180，粉碎目数为70 目，离心转速为4 000 r/min，超声时间为50 min。

表2 正交设计及极差分析

3.4 紫丁香中KR 含量动态变化

以甲醇为萃取剂，在上述最优条件下，对2019年3 月19 日至4 月5 日的18 批紫丁香花样品中KR 的含量进行测定，结果见图6。

图6 紫丁香花开放程中KR 含量变化

由图6 可以看出，在紫丁香花开放过程中，KR的含量在第9 天达到最高(8.58 mg/g)。之后随着花的开放，KR 的含量逐渐降低。KR 的含量整体呈现出先升高后降低的趋势。

3.5 方法学考察

3.5.1 重复性试验

精确称量紫丁香花样品6 份，按上述最优条件制备样品，并按照2.3 项下色谱条件进样。结果表明，KR 的相对标准偏差(RSD)为1.78%，说明本试验方法重复性好。

3.5.2 精密度试验

吸取对照品溶液进样，按照2.3 项下色谱条件连续进样6 次。结果表明，KR 的RSD 为0.43%，表明仪器精密度良好，可以准确反映物质的量。

3.5.3 稳定性试验

精密称取紫丁香花1 份，按2.2 项下制备样品，并按照2.3 项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h 进样。结果表明，KR 的RSD 为1.89%，说明供试液中KR 在24 h 内基本稳定。

3.5.4 加样回收试验

称取已知KR 含量的紫丁香花样品6 份，按2.2项下的操作步骤制备供试品溶液，进行测定样品中所含KR 的含量，再分别加入KR 标准品，按照2.3项下色谱条件进样，KR 的平均加样回收率分别为99.09%，其RSD 值分别为1.74%。

4 讨论

文献研究[22]表明，KR 具有保肝、抗肝毒性、神经保护、抗氧化、抗衰老等多种药理活性。本课题组前期研究表明，KR 具有较好的促凝血活性，促凝血活性和云南白药相当[12]。并且KR 在紫丁香花中的含量相对较高，具有一定的研究价值。本研究确定的紫丁香花中KR 的最佳提取工艺和最佳采收时间可以为紫丁香花中KR 的开发利用提供一定的参考。

研究结果表明，以甲醇为提取溶剂，固液比为1 ∶180，粉碎目数为70 目，超声时间为50 min，离心转速为4 000 r/min 时，紫丁香花中的KR 提取率最高。在紫丁香花开放过程中，紫丁香花中的KR 含量在3 月27 日(第9 天)达到最高(8.58 mg/g)，之后逐渐减少。KR 的含量整体呈现出先升高后降低的趋势。因此要想充分利用紫丁香花中的KR，在花开中期采摘比较好。