基于网络药理学的六味地黄汤治疗痴呆机制研究

王铷贾亚泉宋军营刘丽君詹向红侯俊林刘永 闫国立李宁张振强

河南中医药大学中医药科学院，郑州450046

痴呆是记忆和认知功能减退的神经性疾病，主要包括记忆、日常生活能力、已习惯的一些技能以及社交技巧和情绪控制能力的全面障碍[1]。根据2018 年的数据统计，现在中国的痴呆症患者已经超过了1 000 万人，这些人中60%患有阿尔茨海默症[2]。预估到2050 年，将有超过2 000 万痴呆患者[3]，其中85 岁以上的老人中1/3 患有痴呆[4]。由于痴呆表现出来复杂性和非单一性的症状，与中医药治疗疾病遵循的辨证施治和整体观念的治疗原则相吻合，因此用中医药的方法治疗痴呆方面的疾病就愈发凸显出诸多优势。

六味地黄汤由熟地黄、泽泻、茯苓、牡丹皮、山药、山茱萸6 味中药组成。6 味药合用，则有“三补三泻”之良剂之称，为滋阴补肾的名方[5]。方中熟地黄滋阴补血;泽泻利水渗湿，泄热;牡丹皮凉肝泻火，活血化瘀;山茱萸消炎抗菌，益肾固精;山药健脾养胃，益肺止咳;茯苓利水渗湿，健脾和胃。药理学研究发现:熟地黄可以抗氧化，并且可以改善脑的功能障碍[6];牡丹皮具有保护心血管系统的功能[7];山茱萸可以调节血糖和血脂[8];茯苓可以抗炎[9];熟地黄、山茱萸和山药可以调解中枢神经，增强学习能力和记忆能力;山茱萸、山药和茯苓可以促使脑细胞的发育功能[10]。

网络药理学是指用系统生物学的研究方法来进行药理学研究的一种新型技术方法，从整体观的角度认识并掌握了药物与疾病之间的相互作用关系。该科学的内涵为“异病-同证-同治”，即不同的疾病在其发展过程中表现出了相似的症状，选用相同的治疗方法来对其进行治疗[11]。网络药理学提供了一种系统级的研究方法来认识所研究疾病的发病作用机制[12]，在复方药物的研究中运用“多组件，网络目标”模式发现疾病线索、识别药物活性化合物靶标和预测各种适应证[13]，推断药物的小分子和基因组成以及蛋白质等的网络和药物活性化合物主要靶点的相关性，进而取得有益于研究的结果[14]。我们通过网络药理学方法探讨六味地黄汤治疗痴呆的药物成分及分子的作用途径，通过建立“药物成分-靶点-通路”之间的关系的网络图[15]，筛选出了与该疾病有关的关键靶点与通路，进而探讨六味地黄汤对治疗痴呆疾病的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 六味地黄汤主要活性成分及数据库的构建

通过TCMSP 数据库(http:// lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)筛选出六味地黄汤中熟地、山茱萸、丹皮、泽泻、山药、茯苓的所有候选化合物。这个数据库包含这些化合物的药代动力学特性，涉及口服生物利用度、水溶性、药物相似性等。目标化合物的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)有助于预测其治疗的生物活性。根据TCMSP 的建议，口服后OB≥30%具有良好吸收，DL≥0.18 表明该化合物在化学上适合药物开发。

1.2 六味地黄汤中活性化合物相关靶点与疾病靶点筛选

通过TCMSP 数据集(http://tcmspw.com/tcmsp.php)查询六味地黄汤中六味中药的主要活性化合物的作用靶点信息。以“AD”“T2DM”“INS”“CP”为关键词，从GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/，v4.12.0)中筛选出与痴呆相关的靶点。运用Uniport 数据库(http://www.uniprot.org/)获取化合物和疾病相关靶点的标准基因名称和对应的UniProt ID。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）的网络构建

通过STRING(https://string-db.org/)数据库将检索到的六味地黄汤有效成分靶点与痴呆靶点相关联，限定Organism 为“Homo sapiens”。在这项研究中，设置相关度≥0.700 的置信度得分作为截止值，得到靶标蛋白相互作用PPI 网络、化合物-靶点-疾病网络。

1.4 基因本体论（GO）分析与KEGG 信号通路富集分析

运用WebGestalt 数据库(http://www.webgestalt.org/)对药物成分与疾病的188 个交集靶点进行GO 分类富集分析，设定阈值(P＜0.05);通过KOBAS 3.0 对六味地黄汤治疗痴呆的候选靶点进行KEGG 通路富集分析，使用https://www.omicshare.com/tools/在线工具绘制KEGG 气泡图，选择P＜0.05的相关途径，建立了靶点通路和组成通路网络以反映靶点与痴呆相关通路之间相互作用。

1.5 构建“成分-核心靶点-通路”网络图

为进一步探索六味地黄汤活性成分在痴呆治疗中的多层次作用机制，对KEGG 通路富集前20 个条目进行分析并结合文献检索，筛选出可能治疗痴呆的通路，找出六味地黄汤主要成分对治疗痴呆富集在这些通路上的靶标，与活性成分交集靶点进行匹配，运用Cytoscape 3.2.1 制图软件构建“疾病-药物-成分-靶点-通路”相互作用网络图。

2 结果

2.1 六味地黄汤主要活性成分的筛选

通过TCMSP 数据库以及相关文献检索得到六味地黄汤的活性化合物453 个，以口服生物利用度OB≥30%且药物相似性DL≥0.18 筛选得到有效活性成分72 种，其中熟地黄2 个、山茱萸20 个、牡丹皮11 个、泽泻8 个、山药16 个、茯苓15 个。去掉重复值后，按照OB 值大小排列，筛选出前20 种六味地黄汤治疗痴呆的主要活性化合物，见表1。

表1 20 种六味地黄汤主要活性化合物基本信息

2.2 六味地黄汤主要活性化合物的相关靶点

运用TCMSP 数据库，以口服生物利用度OB≥30%且药物相似性DL≥0.18 筛选出六味地黄汤的主要活性化合物，并找出与其相关的靶点453 个。其中与痴呆相关的靶点，见表2。

表2 部分六味地黄汤主要活性化合物的相关靶点

续表2

2.3 六味地黄汤治疗痴呆的潜在基因

从GeneCards 数据库中筛选出与痴呆相关的靶点，输入“cerebral ischemia”“diabetes”“dementia”，GeneCards 数据库15 244个基因，删除重复值后有9 681个，通过TCMSP 数据库得到六味地黄汤主要活性成分靶点453 个，删除重复值后有209 个，六味地黄汤主要活性化合物靶点与治疗痴呆相关的靶点取交集，可以得到六味地黄汤治疗痴呆疾病的潜在靶点。见图1。

图1 六味地黄汤治疗痴呆的潜在靶点

2.4 六味地黄汤与痴呆PPI 的网络构建

采用STRING 数据库，利用该数据库中Multiple proteins Search，进行PPI 网络构建分析，把六味地黄汤中188 个潜在基因导入该数据库，得到蛋白-蛋白相互作用的网络，见图2。图中可知节点数197，边数3 162，这些靶点代表中节点度较高的有VEGFA，NOS2，NOS3，TNF 等，它们作为这个网络中的主要靶点，可能在六味地黄汤治疗痴呆时起着关键的作用。把节点度高的靶点蛋白用图2 同样的方法制作成图，见图3。

2.5 GO 富集分析与KEGG 途径分析

用WebGestalt 数据库将与检索到的六味地黄汤中六个中药活性化合物靶点与痴呆疾病靶点的188个交集基因，导入进行GO 分类富集分析，设定其阈值(FDR＜0.05)，出现排名前20 的生物途径以及KEGG 的信号通路，见表3、图4。通过富集分析可见潜在通路可以聚为9 种红色、蓝色、绿色、紫色、粉色、黄色等分别代表不同的类别，结果见图5。

图2 六味地黄汤与痴呆PPI 网络图

图3 主要靶点蛋白的PPI 网络图

表3 KEGG 的20 条富集通路

续表3

2.6 靶点通路分析

根据KOBAS 3.0 数据库，将出现排名前20 的生物途径以及KEGG 的信号通路进行GO 功能富集分析，绘制柱状图和气泡图，见图6。Pvalue 的取值范围一般为[0，1]，Pvalue 值越接近于0，表示富集程度越大。

2.7 成分-靶点-疾病-通路的网络构建

通过KOBAS3.0 对六味地黄汤治疗痴呆疾病的交集靶点的188 个交集基因进行KEGG 通路的富集分析，最后得到的药物-成分-靶点-疾病网络图，见图7。其中红色代表疾病，绿色代表六味地黄汤中所含的药物，蓝色代表六味地黄汤中各药的主要活性成分，紫色代表作用排名前20 的KEGG 作用通路，黄色为痴呆疾病靶点与六味地黄汤活性成分靶点的交集靶点。

图4 GO 富集分析显示的六味地黄汤的主要生物途径

图5 六味地黄汤各潜在通路的主要靶点

图6 六味地黄汤靶点的GO 富集气泡图

图7 六味地黄汤与痴呆的药物-成分-靶点-通路网络图

3 讨论

现代药理研究认为，六味地黄汤可以提高免疫器官的功能、清除自由基、明显减轻脂质过氧化物被自由基的侵袭，因此对大脑的氧化性损伤具有保护作用[16]。方中熟地的活性化合物地黄多糖B 具有抗肿瘤活性和调节免疫功能的作用[17];茯苓中的β 谷甾醇和茯苓多糖具有通过干预神经系统、内分泌系统以及免疫系统改善老年性痴呆以提高学习和认知功能的作用[18];牡丹皮中的丹皮酚具有抑制炎症因子、镇静、抗炎的作用[19];山茱萸中环烯醚萜及多糖类具有抗氧化、神经保护、抗肿瘤、抗老年痴呆等作用[20-23];山药多糖具有抗氧化和降低氧化应激损伤的作用[24-25];泽泻醇能够抑制内皮细胞损伤和炎症反应、减少脂质过氧化和抗氧化酶活性而防止氧化应激[26-27]。

通过TCMSP 数据库检索得到六味地黄汤的活性成分72 个，对应成分靶点458 个，删除重复值后209个，痴呆疾病相关靶点9 681个，疾病靶点与活性成分靶点的交集靶点188 个。通过对188 个靶点蛋白进行PPI 研究发现，一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，NOS3)、γ-氨基丁酸受体亚基α-2(Gamma aminobutyric acid receptor subunit α-2，GABRA3)、溶菌酶(Lysozyme，LYZ)、胺氧化酶(Amine oxidase，MAOB)等靶点蛋白的度值大，说明度值大的这些靶点蛋白在六味地黄汤治疗痴呆的过程中发挥着重要的作用。

通过GO 富集分析与KEGG 信号通路的富集分析结果，六味地黄汤治疗痴呆与血清素能突触(Serotonergic synapse)、cAMP 信号通路(cAMP signaling pathway)、胆碱能突触(Cholinergic synapse)、IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)、胆碱能突触(Thyroid hormone signaling pathway)等信号通路相关，六味地黄汤治疗痴呆主要涉及氧化应激、物质代谢、胰岛素抵抗、DNA 复制及转录等，并且有激素、受体、蛋白、信号分子等物质的参与[28]，IL-6 位于7 号染色体，通过IL-6 受体α 诱导转录炎症应答;TNF 与自身免疫性疾病、胰岛素抵抗、肿瘤等多种疾病的易感性相关;NOS3 具有抑制血小板、调节血流、舒张血管等重要功能;TP53 对多种细胞应激反应，调节靶基因的表达;ESR 可介导细胞膜ESR 通过雌激素信号机制阻止谷氨酸兴奋性毒性损伤，对神经元起保护作用。

我们通过网络药理学的研究方法进行了药物主要活性成分与相关靶点的预测分析。但是药物主要活性化合物的检索筛选与药物相关靶点的预测以及实验结果的讨论分析都需要实验证据，并且检索出的活性成分不能对六味地黄汤的药效进行完全概括，后续研究还需要进一步设计一些体内与体外的实验来验证。