11 种枸杞子甜菜碱和6 种重金属含量研究

孙红亮

（山西农业大学 小麦研究所，山西 临汾044100）

山西是传统中药材枸杞子产地之一，主要以野生为主。近年，山西人工栽培枸杞面积逐步扩大，为农业增产和农民增收起到了推进作用。据《中国药典》（2015 年版第一部）［1］中记载，甜菜碱是枸杞中具有生物活性和药理作用的重要成分［2～6］，是评价枸杞子内在质量的重要指标。单纯追求经济发展带来的环境污染［7，8］，直接或间接影响中药材重金属元素的积累，进而对服用中药产品的人的健康产生影响，甚至会引发重金属中毒［9～14］，因此重金属含量是评价中药材安全性指标之一［15］。关于山西产枸杞子甜菜碱含量及重金属含量安全性研究，少见系统报道，因此加强对山西产枸杞子甜菜碱和重金属含量研究，有其现实意义。本试验对11 个品种枸杞子中甜菜碱和重金属（锌、铅、镉、砷、汞、铜）含量进行测定，甜菜碱含量测定使用紫外分光光度法［16～18］，重金属（锌、铅、镉、砷、汞、铜）含量测定使用ICP-MS 法［19］，并分析品种间重金属含量差异及重金属元素含量间的差异，为枸杞选育高活性成分及低有害重金属含量的枸杞新品种提供依据，为山西产枸杞子重金属安全风险评估参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

11 个品种枸杞子包括S1（1）、蒙杞1 号（2）、S2（3）、S3（4）、S4（5）、S5（6）、S6（7）、S7（8）、S8（9）、宁杞1 号（10）、晋红宝（11），均采自山西农业大学小麦研究所韩村国家试验基地（山西省临汾市郊区），7 月初夏季鲜果各250 g。放枸杞子于电热鼓风干燥箱中，55 ℃持续烘干25 h，粉碎，过40 目筛，冰箱冷藏（4 ℃）保存。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

SCIENTZ-50YG1A 冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限责任公司；101-1A 电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；DR6000 紫外可见分光光度计：美国哈希；SC-3610 低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；GM0.33A 隔膜真空泵：天津市津腾试验设备有限公司；电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）：仪器型号ICAP PQ，赛默飞世尔科技有限公司；电子天平：感应量为0.1 mg，型号：BSA124S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；微波消解仪：配有聚四氟乙烯消解内罐，型号：TOPEX，上海屹尧仪器科技发展有限公司；氩气（Ar）∶氩气（99.995%）；氦气（He）∶氦气（99.995%）。

1.2.2 试剂

浓盐酸：洛阳吴华化学试剂有限公司，分析纯；甜菜碱：坛墨，P/N：75422，20 mg，97%；雷氏盐：阿拉丁，25 g，Lot：c2003142，分析纯；无水乙醚：格里斯（天津）医药化学技术有限公司，分析纯；丙酮：安谱生产，色谱纯；浓硝酸：1.42 g·L-1，洛阳昊华化学试剂厂，500 mL，优级纯；双氧水：30%，天津市光复科技发展有限公司；元素贮备液（100 mg·L-1）：铅、镉、砷、铜、锌采用经国家认证并授予标准物质证书多元素标准贮，标准物质批号：19DA282，国家有色金属及电子材料分析测试中心；Hg 贮备液（1 000 mg·L-1）：采用经国家认证并授予标准物质证书单元素标准贮，标准物质批号：204047-3；Rh 贮备液（1 000 mg·L-1）：采用经国家认证并授予标准物质证书单元素标准贮，标准物质批号：204020-2；蒸馏水。

1.3 试验方法

1.3.1 甜菜碱含量测定试验方法［16～18］

所需溶液配制：15 g·L-1饱和雷氏盐溶液：取雷氏盐1.5 g，取90 mL 蒸馏水加入其中，搅拌，用浓盐酸调节pH=1.0，室温下搅拌45 min，抽滤，定容至100 mL。99%乙醚溶液：先取99 mL 无水乙醚，再取1 mL 蒸馏水加入其中，摇匀。70%丙酮溶液：先取70 mL 丙酮，再取30 mL 蒸馏水加入其中，摇匀。0.72 g·L-1甜菜碱标准溶液：取甜菜碱0.018g，于25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至25 mL，摇匀。

试样溶液制备：取2.0 g 烘干搅碎的样品，加入80 mL 蒸馏水，于室温放置3 h，不停搅拌、混匀、抽滤、弃残渣。用浓HCl 调节pH=1.0，抽滤后定容至100 mL。吸取3 mL 于10 mL 离心管中，放入冰箱中15 min，加入5 mL 1.5 g 饱和雷氏盐溶液，再放入冰箱1 h，取出后4 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入99%的乙醚5 mL，4 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入5 mL 70% 丙酮溶液，以70%丙酮溶液为空白，λ=523 nm 处测定吸光度。

空白试样：不加样品，按照与试样溶液制备相同步骤制备空白试样。

加标回收试验：称取0.15 g 枸杞样品于锥形瓶中，加入一定量的甜菜碱标准溶液，按照试样溶液制备操作。

甜菜碱标准工作曲线建立：分别移取0、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 甜 菜 碱 标 准 溶 液 于10 mL 离心管中，再分别加入3.0、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL 蒸馏水于10 mL 离心管中，加入5 mL 雷氏盐溶液，然后按照样品溶液制备操作。70%丙酮溶液为空白，按浓度由低到高顺序依次测定其吸光度A。

甜菜碱标准曲线绘制：以浓度为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制甜菜碱标准曲线（图1），回归方程为y=0.619 6x−0.080 6，R2=0.998 4

图1 甜菜碱标准曲线Fig.1 Standard curve of betaine content

试样测定：取试样溶液所得滤液3 mL 于25 mL 容量瓶中，按与工作曲线建立相同的分析条件进行试样测定。

空白试验：按与试样测定相同的分析条件进行试样测定。

加标回收试验：按与试样测定相同的分析条件进行加标回收测定（表1）。

1.3.2 重金属含量测定试验方法［19］

样品溶液制备：取枸杞子样品0.5 g，置于消解罐中，依次加6 mL 硝酸、2 mL 双氧水，静置3 h。将消解罐置于微波消解仪中消解，微波消解仪的设定程序（表2），之后取出消解罐，放置常温后，转移至25 mL 硬质塑料比色管中，定容至25 mL，静置过夜，取上清液1 mL 置于10 mL 塑料比色管中，加入9 mL 3%硝酸水，待测；同时测定空白。

空白试样制备：不加样品，其它同样品溶液。

ICP-MS 仪器工作条件见表3。

标准曲线的制作：Cu、Zn、Pb、As、Cd 使用元素储备液（19DA282）配制标准曲线，曲线梯度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μg·L-1；Hg 使用标准溶液配制成标准曲线，曲线梯度为0.2、0.5、1.0、5.0、10 μg·L-1。内标：10 μg·L-1Rh 标准溶液。以待测元素的浓度为横坐标，待测元素与所选内标元素响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

表2 微波消解仪的设定程序Table 2 Setting procedure of microwave digestion instrument

重金属元素Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd 的回归方程和相关系数见表4。

试样溶液的测定：将空白溶液和试样溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定待测元素与内标元素信号响应值，根据标准曲线得到消解液中待测元素的浓度。

表3 仪器工作条件Table 3 Working conditions of the instrument

表4 重金属元素回归方程和相关系数Table 4 Regression equation and correlation coefficient of heavy metals

1.3.3 质量控制

标准物质：铅、镉、砷、铜、锌贮备液，采用经国家认证并授予标准物质证书多元素标准贮，标准物质批号：19DA282，国家有色金属及电子材料分析测试中心生产；Hg 贮备液，采用经国家认证并授予标准物质证书单元素标准贮，标准物质批号：204047-3；Rh 贮备液，采用经国家认证并授予标准物质证书单元素标准贮，标准物质批号：204020-2。

线性关系考察：各元素的标准曲线的相关系数大于0.999。

内标响应值：内标的响应值介于校准曲线响应值的85%～115%。

加标回收试验：称取0.5 g 枸杞子于消解罐中，加入一定量的标准溶液，按与试样制备相同步骤制备。重金属各元素加标回收率见表5。

设备检出限：重金属元素Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd 含量测定，取样量为0.5 g，定容到25 mL 时，各元素检出限见表5。

1.4 统计分析

不同品种枸杞子间单个重金属元素含量比较采用SPSS19.0 进行单因素方差分析，采用Duncan 法进行品种间两两比较。多个品种枸杞子多个重金属元素含量间的相关分析采用Spearman 相关系数。

2 结果与分析

2.1 甜菜碱含量试验结果与分析

按公式计算枸杞子中甜菜碱含量：

式中，W：枸杞子中甜菜碱含量，%；A：样品的吸光度；a：标准曲线截距；V：萃取液体积，mL；b：标准曲线斜率；f：稀释倍数；m：样品的称重质量，g。

11 个品种枸杞子甜菜碱含量及显著性差异结果见表6。11 个品种枸杞子的单因素方差F 值为51.176，显著性概率值为0.000，小于0.01，表明测定的11 个品种间甜菜碱含量差异极显著，有必要进行多重比较。11 个品种中，品种5 甜菜碱含量最低为1.993±0.065 mg·kg-1，品种4 的甜菜碱含量最高为2.797±0.086 mg·kg-1，品种5、6、1、3 无差异，但品种5、6 极显著低于品种7、2、11、9、10、8、4（P＜0.01）。品种1、3、7、2、11 无差异，但极显著低于品种9、10、8、4（P＜0.01）。品种9、10 无差异，但品种9 极显著低于品种8、4（P＜0.01），品种10、8、4 无差异。

11 种枸杞子甜菜碱含量范围1.993%～2.797%，甜菜碱含量＞0.3%，符合《中国药典》要求。与黄钰馨等［17］用高效液相色谱法测定宁夏宁夏银川市贺兰县产的10 批枸杞子甜菜碱含量范围1.91%～2.55%，以及《中国药典》收录的薄层色谱法的测定范围1.88%～2.60%相当。说明山西产的枸杞子在甜菜碱含量方面与宁夏枸杞子无差异，也说明本试验采用的测定方法可行。杨志敏等［20］用高效液相色谱法测定购买于甘肃的枸杞子中甜菜碱含量1.6%。方丽等［21］HPLC 法测定宁夏枸杞子中甜菜碱的含量范围0.595%～0.832%，庄红艳等［22］用离子色谱法测定枸杞子中甜菜碱含量范围0.661%～0.897%，比本试验及黄钰馨［17］的测定结果偏低，可能与购买的枸杞子存放时间过长有关系，吴燕等［23］研究枸杞生长发育过程，枸杞果实渐渐成熟，其甜菜碱和黄酮含量呈下降走势，存放时间越长，甜菜碱和黄酮的含量越低。

表5 加标回收率和ICP-MS 法检出限Table 5 Standard addition recovery and detection limit of ICP-MS method of Cu，Zn，As，Pb，Hg，Cd

表6 甜菜碱含量Table 6 The betaine content in eleven varieties of Lycium chinensis 单位：%

2.2 重金属元素含量试验结果与分析

11 个品种枸杞子6 种重金属元素含量3 次重复测试平均值、标准差及显著性差异见表7。

As 含 量 差 异：11 个 品种中，品种6 和9 没 有检出，品 种3 的As 含 量 最 高 为0.230±0.003 mg·kg-1，统计分析P值为0.000，11 个 品 种 中As 含量差异极显著。品种6、9、10、7、2 无差异，但品种6、9、10、7 与品种11、1、8、5、4、3 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种2、11 无差异，但品种2极显著低于品种1、8、5、4、3（P＜0.01）。品种11、1、8、5 无差异，但极显著低于品种4、3（P＜0.01）。品种4 极显著低于品种3（P＜0.01）。药典规定砷不得超过2 mg·kg-1，11 个品种砷含量都在规定范围内，安全性较高；

Cd 含量差异：11 个品种中，品种3 的Cd 含量最低为0.053±0.006 mg·kg-1，品种5 的Cd 含量最高 为0.233±0.012 mg·kg-1，统 计 分 析P值 为0.000，11 个品种中Cd 含量差异极显著。品种3 与其它品种有差异，极显著低于其它品种（P＜0.01）。品种11、7、6、8 无差异，但品种11 与品种1、10、2、9、4、5 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种7、6、8、1 无差异，但品种7、6、8 极显著低于品种10、2、9、4、5（P＜0.01）。品种1、10、2无差异，但品种1、10 极显著低于品种9、4、5（P＜0.01）。品种2、9 无差 异，极显著低于 品种4、5（P＜0.01）。品种4、5 无差异。药典规定镉不得超过0.3 mg·kg-1，11 个品种镉含量都在规定范围内，安全性较高；

Pb 含量差异：11 个品种中，品种1、2、7、9、10、11 没有检出，品种8 的Pb 含量最高为0.082±0.021 mg·kg-1，统计分析P值为0.000，11 个品种中Pb 含量差异极显著。品种1、2、7、9、10、11、6、4无差异，但品种1、2、7、9、10、11、6 极显著低于品种5、3、8（P＜0.01）。品种4、5、3 无差异，但极显著低于品种8（P＜0.01）。药典规定铅不得超过5 mg·kg-1，11 个品种铅含量都在规定范围内，安全性较高；

表7 重金属元素（Cu，Zn，As，Pb，Hg，Cd）含量Table 7 The contents of Cu，Zn，As，Pb，Hg，Cd in eleven varieties of Lycium chinensis 单位：mg·kg−1

Hg 含 量差 异：11 个 品 种中，品 种1 的Hg 含量最 低 为0.011±0.003 mg·kg-1，品 种8 的Hg 含 量最 高 为0.042±0.003 mg·kg-1，统计分析P值为0.000，11 个品种中Hg 含量差异极显著。品种1 与其它品种有差异，极显著低于其它品种（P＜0.01）。品种7、5、4、10 无差异，但品种7 极显著低于品种6、2、3、11、9、8（P＜0.01）。品种5、4、10、6、2、3、11、9 无差异，但品种5、4、10、6 极显著低于品种8（P＜0.01）。品种2、3、11、9、8 无差异。药典规定汞不得超过0.2 mg·kg-1，11 个品种汞含量都在规定范围内，安全性较高；

Cu 含 量 差 异：11 个 品 种 中，品 种3 的Cu 含 量最低 为11.9±0.3 mg·kg-1，品种8 的Cu 含量最高为22.8±0.9 mg·kg-1，统计分析P值为0.000，11个品种中Cu 含量差异极显著。品种3 与其它品种有差异，极显著低于其它品种（P＜0.01）。品种6、10、2、1 无差异，品种6 与品种7、11、4、9、5、8 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种10、2、1、7 无差异，品种10 与品种11、4、9、5、8 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种2、1、7、11 无差异，但品种2、1、7 与品种4、9、5、8 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种11、4 无差异，但品种11 与品种9、5、8 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种4、9、5 无差异，但极显著低于品种8（P＜0.01）。药典规定铜不得超过20 mg·kg-1，11 个品种中，除8 号品种超出药典规定铜含量最高值18.5%，其余10 个品种都在规定范围内，安全性较高。姜涛等［19］用同样方法测定了宁夏中宁产的32 份枸杞子5 种重金属元素的含量，其中铜含量1.2～7.1 mg·kg-1。山西临汾产枸杞子铜含量最低平均值比宁夏中宁产铜含量最高平均值高出67.61%，山西临汾产11 个品种铜元素的含量普遍明显比宁夏中宁产的枸杞子含量高，但基本都在药典规定的范围内，这可能与环境、栽培措施等有关。

Zn 含 量 差 异：11 个 品 种中，品 种3 的Zn 含量最低为21.6±0.4 mg·kg-1，品种4 的Zn 含 量最高为39.8±2.8 mg·kg-1，统计分析P值为0.000，11个品种中Zn 含量差异极显著。品种3、11、6、1 无差异，但品种3 极显著低于品种7、5、10、2、9、8、4（P＜0.01）。品种11、6、1、7 无差异，但品种11、6、1 与品种5、10、2、9、8、4 有差异，极显著低于这些品种（P＜0.01）。品种7、5、10、2 无差异，但极显著低于品种9、8、4（P＜0.01）。品种9、8 无差异，但极显著低于品种4（P＜0.01）。

不同品种枸杞子重金属元素含量（变量）间的相关分析（表8）：对11 个品种枸杞子进行6 个变量间的相关分析，11 个品种枸杞子6 个重金属元素含量间Spearman 相关系数表明，As 和Pb、Zn 和Cd，相关性极显著（Sig＜0.01），Cu 和Zn，相关性显著（Sig＜0.05）。

不同品种枸杞子6 个重金属元素含量的种间聚类分析：对11 个品种枸杞子进行种间聚类分析，以Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd 的含量为聚类变量，组间联接，平均Euclidean 距离进行类聚，绘制得聚类分析树状图（图2）。由图2 可见，当平均Euclidean 距离分别为24、8、5、3.5 时，11 个品种分为两大、三大、五大、六大集群，品种1、11、6、7 相似度较高，品种2、10 相似度较高，聚类结果可以看出同一集群之间的重金属元素含量相似度较高，不同集群之间重金属元素含量差异较大，可初步判断品种8、4与其它品种枸杞子中重金属含量的差异最大。从重金属元素含量的角度来看，品种8 是一个重金属元素含量高的品种，可以看作富含重金属元素品种。

表8 Spearman 相关系数Table 8 Spearman correlation coefficient

图2 Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd 的含量为变量的种间聚类分析Fig.2 Interspecific cluster analysis with Cu，Zn，As，Pb，Hg and Cd contents as variables

不同品种枸杞子6 个重金属元素含量的变量聚类分析：对11 个品种枸杞子进行变量间聚类分析，以As、Pb、Hg、Cd、Cu、Zn 的含量为聚类变量，组间连接，Pearson 相关性，绘制得聚类分析树状图（图3）。当平均Euclidean 距离分别为24、15、6 时，6 个重金属元素含量分为两大、三大、五大集群，集群之间差异明显。Cu、Zn 的含量相似度最大。Hg和其它元素的差异最大。

3 讨论

3.1 重金属含量研究对枸杞抗根腐病育种的意义

图3 Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd 的含量为变量的变量间聚类分析Fig.3 Cluster analysis among variables with Cu，Zn，As，Pb，Hg and Cd contents as variables

本试验重金属含量为变量的种间聚类分析，对枸杞抗根腐病育种很有意义。枸杞根腐病是枸杞最主要的病害，由镰刀菌引起的真菌性病害。在枸杞生育期不分阶段都可以发生，主要是根部腐烂坏死，叶片发黄脱落或者青枯脱落，植株死亡。严重的情况下，5 年累计死亡率达30%以上，给农民造成巨大损失。目前防治根腐病主要方法是清除病死植株，给根部土壤灌多菌灵杀菌液，然后重新补栽，属于发病后一种补救措施，费时、费力、费钱，效果也不好。培育抗根腐病的枸杞品种，是解决枸杞根腐病的根本办法。枸杞子属于植物药，本身所含的重金属含量与枸杞的生长环境（土壤、大气）、栽培措施（水、肥、农药）、枸杞的遗传因素（对重金属的主动吸收、富集）有关。枸杞植株体内的重金属元素Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd主要通过根系从土壤中吸收，在相同的生长环境、栽培措施下，不同品种果实Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd的含量，反映了不同品种对Cu、Zn、As、Pb、Hg、Cd的吸收能力的内在规律，是由遗传因素决定的。抗根腐病能力强的品种，根系强壮，根系吸收活力强，有效吸收面积大，吸收重金属元素的能力强，体内积聚的重金属含量就高。由聚类分析树状图可以看到，品种4、8 与其余品种聚类最远，表明品种4、8 与其它品种差异最大。笔者经连续多年大田试验观察，品种3、11 根腐病最严重，而品种3、11处在11 个品种分为三大集群的第3 集群，聚类较近。品种4 抗根腐病很强，品种4 与品种3、11 聚类最远，这为抗病育种提供了一条借鉴思路，即在距离易感根腐病品种所在的聚类最远的聚类中，有可能找到抗根腐病的育种材料。人体现代医学研究表明，人体血液中微量元素的含量与人体发育、疾病密切相关［24～26］，借鉴人体现代医学研究成果，能否把这种方法做成枸杞育种选择抗根腐病材料的模型，有目的的去选择抗根腐病材料，缩短寻找抗根腐病材料的周期。同时这种重金属含量为变量的种间聚类分析的方法，有助于对枸杞育种材料的抗根腐病能力进行预测，与易感根腐病的品种聚类近的，抗根腐病的能力都较弱，与易感根腐病的品种聚类最远的，抗根腐病的能力都较强，通过这种方法能对枸杞育种后代材料抗根腐病能力进行预判。是采用更多的微量元素和重金属元素含量做变量，还是采用几种代表性的微量元素和重金属元素含量做变量，更能客观反映种间聚类分析在枸杞抗根腐病育种中的作用，都值得后续继续研究。

4 结论

（1）山西临汾产的11 个品种枸杞子甜菜碱含量差异极显著（P＜0.01），通过品种选育，可选育出甜菜碱含量高的品种。11 个品种枸杞子甜菜碱含量与宁夏产枸杞子无差异。

（2）山西临汾产的11 个品种枸杞子重金属元素铅、镉、砷、汞、铜含量差异极显著（P＜0.01），重金属元素铅、镉、砷、汞、铜安全性较高，基本都在《中国药典》（2015 年第一部）规定之内（8 号品种铜含量超出规定范围）。11 个品种枸杞子铜元素的含量明显比宁夏中宁产的枸杞子含量高。建议在枸杞栽培管理中尽量少用或不用含铜杀菌剂。

（3）重金属元素含量做变量的种间聚类分析方法对枸杞抗根腐病育种有促进作用，即在距离易感根腐病品种所在的聚类最远的聚类中，能找到抗根腐病的育种材料。在枸杞抗病育种中，把重金属元素含量做变量种间聚类分析方法做成选择枸杞抗根腐病育种材料及预测枸杞育种材料抗根腐病能力的模型，能达到缩短枸杞抗根腐病育种的周期。