UCP3 基因调控C2C12 细胞增殖的研究

何志强，黑伟，张万锋，张燕伟，吴怡琦，蔡春波，杨阳，高鹏飞，李步高，郭晓红

（山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷030801）

骨骼肌是哺乳动物机体的重要组成部分，与哺乳动物的运动能力、代谢能力具有密切的联系［1］。骨骼肌细胞生长发育是一个复杂的生理过程，主要包括骨骼肌干细胞增殖、迁移和分化，成肌细胞的增殖、分化和肌管融合等环节［2］。其中，骨骼肌成肌细胞的增殖是维持骨骼肌功能的基础。当骨骼肌受到损伤时，机体可以通过成肌细胞的增殖和分化进行损伤修复，维持骨骼肌的功能。骨骼肌急性损伤后，可以激活骨骼肌中的MAPK/MEK 信号通路，诱导骨骼肌卫星细胞的增殖，并促进成肌分化，完成骨骼肌的损伤修复［3］。电刺激可以促进肌萎缩大鼠的骨骼肌中胰岛素样生长因子1（IGF-1）表达，抑制Myostatin基因表达，促进骨骼肌卫星细胞增殖，缓解骨骼肌的萎缩程度［4］。C2C12 细胞是小鼠骨骼肌的成肌细胞系，具有很强的增殖和成肌分化能力，是研究骨骼肌发育的模式细胞系。

解偶联蛋白3（Uncoupling protein 3，UCP3）主要在骨骼肌和棕色脂肪（BAT）中表达，是一种位于线粒体内膜上的载体蛋白［5］。UCP3 可以通过质子漏的方式，消散线粒体内膜两侧的质子电化学梯度差，解偶联线粒体的氧化与磷酸化过程，使能量以热能的方式消耗。目前，关于UCP3 的研究主要集中在脂质氧化代谢与产热调节等方面，寒冷条件刺激下，猪可以通过上调UCP3 基因的表达，促进皮下白色脂肪棕色化，增加脂肪产热，维持体温平衡［6］。UCP3 还可以增强脂质的氧化代谢作用［7～9］，减少线粒体中活性氧（reactive oxygen specices，ROS）的产生［10］，使线粒体免受氧化应激造成的损伤［11］。Lin 等［12］发现，90 日龄的莆田黑猪骨骼肌中UCP3 的表达量显著高于其它日龄（P＜0.01）。目前，关于UCP3 对骨骼肌的调控作用的报道较少，功能仍不清楚。本研究以C2C12细胞为研究对象，在有效转染UCP3 过表达与干扰慢病毒载体的基础上，收集不同处理组细胞的RNA 及蛋白，利用qRT-PCR 技术检测增殖相关基因PCNA、Ki67 与凋亡相关基因Bax、caspase3 mRNA 表达量的变化，运用Western Blot 技术检测PCNA 蛋白表达量的变化；通 过CCK-8、EDU 染色探究过表达与干扰UCP3 基因对C2C12 细胞增殖速率的影响，阐明UCP3 基因对C2C12 成肌细胞增殖的调控作用，为骨骼肌中UCP3 的功能研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

C2C12 细胞购自上海盖宁生物有限公司；胎牛血清（FBS）、高糖DMEM、0.25%胰酶购自Gibco 公司；青链霉素混合液、PBS 缓冲液、4%多聚甲醛、Triton X-100、DAPI 染 液 购 自Solaibio 公 司；SDS-PAGE 快速凝胶制备试剂盒、彩虹预染蛋白marker 购自武汉博士得生物工程有限公司；TRNzol Universal RNA Reagent、总RNA 提 取 试 剂 盒购自北京天根生化科技有限公司；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex Taq II 购 自TaKaRa 公 司；CCK-8 试 剂盒、PCNA 单 克隆抗体 购 自Abcam 公 司；β-actin 单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；荧光二抗购自美国LI-COR 公司；EDU 增殖检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司；qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；慢病毒载体由上海吉玛公司构建并包装。

1.1.2 主要仪器

多功能酶标（BioTekSynergy-2，美国）；核酸蛋白测定仪（ND-1 000 Nanodrop，美国）；倒置荧光显微镜（DMi8 Leica，德国）；CO2细胞培养箱（STE-CYCLE Thermo，美国）；实时荧光定量PCR 仪（ABI 7 500，美国）；电泳仪和转膜仪（PowePac BIO-RAD，美国）；远红外光扫描系统（Odyssey CLX LI-COR，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 C2C12 细胞培养

从液氮罐中取出C2C12 细胞，37 ℃水浴锅快速融化，离心弃上清后用完全培养基（10%FBS+1%青链霉素+高糖DMEM）重悬细胞，接种于培养皿中。待细胞汇合度达到80%～90%时，进行传代，每2 d 更换细胞培养液一次。

1.2.2 C2C12 细胞转染及效率检测

取生长状态良好的C2C12 细胞接种到6 孔板中，待细胞汇合度达到50%左右时加入适量慢病毒载体进行转染。本试验分为4 个组，分别为：慢病毒包被过表达对照载体组（OE-NC）、慢病毒包被UCP3 过表达载体组（OE-UCP3）、慢病毒包被干扰对照载体组（Sh-NC）和慢病毒包被UCP3 干扰载体组（Sh-UCP3），每组设置3 个重复。转染72 h 后收集各组细胞，提取总RNA 并反转录成cDNA，运用qRT-PCR 方法检测各组细胞UCP3基因转染效率。qRT-PCR 引物序列如表1 所示。

1.2.3 EDU 检测细胞增殖

将成功转染不同慢病毒载体的细胞每孔5 000个细胞的密度接种于24 孔板中，每组3 个重复。细胞培养12 h 后，更换为50 μmol·L-1的EDU 培养基，CO2培养箱中孵育2 h；倒掉EDU 培养基，加入4%多聚甲醛固定30 min，然后加入200 μL 2 mg·mL-1甘氨酸，室温摇床孵育5 min，PBS 清洗3 次，每次5 min；加入300 μL 0.5% Triton X-100，室温孵育30 min；加入200 μL Apollo 染色液，室温避光孵育30 min；加入0.5% Triton X-100 清洗3 次，每次10 min；加入DAPI 染色液，进行细胞核染色。荧光显微镜下观察染色结果，并使用ImageJ 软件统计EDU 阳性细胞数。

1.2.4 CCK-8 检测细胞增殖

将不同处理组的细胞接种到5 个96 孔板中，每个处理组设置3 个孔重复，每孔大约1 000 个细胞。分别在0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 时加入10 μL CCK-8 溶液，混匀，37 ℃的CO2培养箱中孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm 处的OD 值，并绘制细胞增殖曲线。

1.2.5 细胞总RNA 提取和cDNA 合成

将不同处理组的细胞接种于12 孔板中，每个处理组设置3 个孔重复，待细胞汇合度达到90%左右时，收集细胞并提取总RNA，然后利用TaKa-Ra 公司的反转录试剂盒合成cDNA。反转录程序按照试剂盒说明书进行，合成的cDNA 放入−20℃冰箱保存备用。

1.2.6 qRT-PCR

将合成的cDNA 原液稀释10 倍用于qRTPCR 检测。qRT-PCR 反应的总体积为20 μL：上下游引物各0.35 μL，cDNA2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，RNAase Free ddH2O 补齐至20 μL。反应程序依照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ说明书进行：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 个循环；95 ℃15 s，65 ℃30 s，95 ℃30 s 制作熔解曲线。内参基因为18S rRNA。qRT-PCR 反应的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western Blot

收集不同处理组细胞，充分裂解后提取总蛋白，使用核酸蛋白测定仪测定蛋白浓度。将蛋白样品与上样缓冲液充分混合，100 ℃变性10 min，进行SDS-PAGE 凝胶电泳，程序为：80 V 30 min；100 V 80 min。进行转膜，转膜程序为：100 V 90 min；转膜后放入5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1 h；分别加入β-actin 抗体（1∶2 000）和PCNA 抗体（1∶1 000），4 ℃过夜；加入二抗（1∶20 000），室温孵育1 h；洗膜后利用远红外光扫描系统观察试验结果并拍照。

1.3 数据分析

采用IBM SPSS Statistics 22 软件进行统计学分析，采用独立样本t检验进行差异显著性检验，运用GraphPad Prism 5 软件绘制柱状图。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 UCP3 过表达与干扰转染效率检测

通过慢病毒转染UCP3 过表达与干扰载体到C2C12 细胞中，培养72 h 后采用qRT-PCR 技术检测UCP3 基因表达量的变化，结果显示，过表达与干扰UCP3 组较对照组均有极显著差异（P＜0.01）（图1A 和1B）。转染后细胞可用于后续试验。

2.2 过表达UCP3 抑制C2C12 细胞的增殖

通过慢病毒转染UCP3 过表达载体到C2C12细胞中，通过EDU 染色和CCK-8 试验检测细胞的增殖效果。EDU 染色结果发现，与OE-NC 组相比，OE-UCP3 组中EDU 阳性细胞的数量明显减少（图2A 和图2B）。CCK-8 试验结果发现，细胞培 养12 h 和24 h 时，OE-NC 和OE-UCP3 组 的 细胞数目并没有明显的差异；当细胞培养36 h 和48 h时，OE-UCP3 组的细胞数目明显低于OE-NC 组（图2C）。EDU 染色和CCK-8 试验结果说明，过表达UCP3 可以显著抑制C2C12 细胞的增殖。

2.3 过表达UCP3 对细胞增殖及凋亡相关基因表达量的影响

图1 UCP3 过表达与干扰效率检测Fig.1 The relative expression of UCP3 gene in different groups

图2 OE-UCP3 和OE-NC 组C2C12 细胞的增殖速率Fig.2 Proliferation rate of C2C12 cells in OE-UCP3 and OE-NC groups

通过慢病毒转染UCP3 过表达载体到C2C12细胞中，细胞培养36 h 后通过qRT-PCR 检测增殖和凋亡基因的表达量变化。结果发现，与OE-NC组相比，OE-UCP3 组细胞的增殖基因PCNA和Ki67 的表达量极显著降低，而凋亡基因caspase3 和Bax的表达量极显著升高（P＜0.01）（图3A）。Western Blot 的 试 验 结 果 也 发 现，OE-UCP3 组 细胞中PCNA 蛋白的含量也极显著低于OE-NC 组（P＜0.01）（图3B 和3C）。qRT-PCR 和Western Blot 的试验结果说明，过表达UCP3 可以抑制增殖基因PCNA和Ki67 的表达，促进凋亡基因cas-pase3 和Bax的表达，从而抑制细胞增殖。

图3 OE-UCP3 和OE-NC 组细胞中增殖和凋亡基因的表达量Fig.3 The expression of proliferation and apoptosis genes in OE-UCP3 and OE-NC groups

2.4 干扰UCP3 促进C2C12 细胞增殖

通过慢病毒转染UCP3 干扰载体到C2C12 细胞中，然后分别通过EDU 染色和CCK-8 试验检测细胞的增殖效果。EDU 染色试验结果发现，与Sh-NC 组 相 比，Sh-UCP3 组 中EDU 阳 性 细 胞 的数量明显增多（图4A 和4B）。CCK-8 试验结果发现，细 胞 培 养12 h 时，Sh-NC 和Sh-UCP3 组的细胞数目并没有明显的差异；当细胞培养24 h、36 h和48 h 时，Sh-UCP3 组的细胞数目明显高于Sh-NC 组（图4C）。EDU 染色和CCK-8 试验结果均说明干扰UCP3 可以显著促进C2C12 细胞增殖。

2.5 干扰UCP3 对细胞增殖及凋亡相关基因表达量的影响

通过慢病毒转染UCP3 干扰载体到C2C12 细胞中，细胞培养36 h 后通过qRT-PCR 试验检测增殖和凋亡基因的表达量变化。结果发现，与Sh-NC 组相比，Sh-UCP3 组细胞的增殖基因PCNA和Ki67 的表达量极显著升高（P＜0.01），而凋亡基因caspase3 和Bax的表达量显著降低（P＜0.05）（图5A）。Western Blot 的试验结果也发现，Sh-UCP3 组细胞中PCNA 蛋白的含量也显著高于Sh-NC 组（P＜0.05）（图5B 和图5C）。qRT-PCR和Western Blot 的试验结果说明，干扰UCP3 可以促进增殖基因PCNA和Ki67 的表达，抑制凋亡基因caspase3 和Bax的表达，从而促进细胞增殖。

3 讨论

解偶联蛋白（UCP）家族包含5 个成员，分别是UCP1、UCP2、UCP3、UCP4 和UCP5。UCP 家族成员调控细胞增殖的研究报道较少，而且在不同细胞中的结果并不一致。Elorza 等［13］研究发现，UCP2 可以降低小鼠红细胞线粒体中ROS 的含量，进而激活MAPK/ERK 信号通路，促进红细胞的增殖。Pauline 等［14］研 究发现，UCP2 可以通过降低己糖激酶2（HK2）的活性，抑制小鼠黑色素瘤细胞（B16F10）的糖酵解水平，抑制细胞的增殖。刘颖［15］等研究发现，干扰UCP2 基因表达后，G1/S期的细胞数目明显增加，下咽癌细胞系（FADU）的增殖能力显著降低。安建多等［16，17］研究发现，在大鼠肝脏再生过程中，UCP2 可以通过促进星形细胞的增殖，加速肝脏组织的再生。然而，Zhang等［18］研究发现，敲除UCP2 可以促进人类主动脉平滑肌细胞系（HA-SMC）增殖，而过表达UCP2可以抑制HA-SMC 增殖。张敏等［19］研究发现，过表达UCP4 后，处于S 期的3T3-L1 细胞数目明显增多，促进细胞增殖。Zhang 等［20］研究发现，过表达UCP4 可以促进大鼠网膜组织前体脂肪细胞的增殖，并抑制其凋亡。目前，关于UCP3 对细胞增殖的研究还未见报道。本研究发现，UCP3 可以通过抑制增殖基因PCNA和Ki67 的表达，促进凋亡基因Caspase3 与Bax的表达，进而抑制C2C12 细胞的增殖。

图4 Sh-UCP3 和Sh-NC 组C2C12 细胞的增殖速率Fig.4 Proliferation rate of C2C12 cells in Sh-UCP3 and Sh-NC groups

图5 Sh-UCP3 和Sh-NC 组细胞中增殖和凋亡基因的表达量Fig.5 The expression of proliferation and apoptosis genes in Sh-UCP3 and Sh-NC group

细胞的增殖过程非常复杂，有很多基因参与调控细胞的增殖和凋亡。增殖细胞核抗原（PCNA）在DNA 的复制过程中发挥着重要的作用，可以促进细胞增殖［21，22］。Kong 等［23］研究发现，抑制lncLUCAT1 的表达，可以降低PCNA的表达量，从而抑制人类口腔鳞状细胞癌（OSCC）的增殖。He 等［24］研 究 发 现，lncAK027294 可 以 通 过 促 进PCNA的表达而促进人胃癌细胞（GC）的增殖。Lee 等［25］研究发现，在大鼠肝脏再生过程中，松针提取物可以通过促进PCNA和Ki67 的表达，从而促进肝脏细胞的增殖，加速肝脏再生。本研究也发现，过表达UCP3 基因，可以通过降低PCNA的表达量抑制C2C12 细胞的增殖。Caspase3 与Bax是重要的凋亡基因，其表达量与细胞增殖具有明显的负相关。抑制人类泛素化因子E4B（UCE4B）的表达，可以促进caspase3 的表达，进而抑制人鼻咽癌细胞的增殖［26］。Wang 等［27］研究发现，百合提取物通过上调caspase3 的表达，明显增加G2/M 期的细胞数量，抑制人胃癌细胞系SGC-7901 的增殖，并促进其凋亡。熊去氧胆酸（UDCA）可以通过抑制P53/Bax 信号通路降低Bax 蛋白的含量，进而抑制大鼠肝细胞凋亡［28］。Pan 等［29］研究发现，培养基中添加氟化物，可以促进C2C12 细胞中Bax的表达，抑制细胞增殖，加速细胞凋亡。韩宇等［30］研究发现，miR-19b 可以通过抑制Bax的表达，促进P19CL6 细胞的增殖，抑制其凋亡。本研究也发现，UCP3 可以促进caspase3 与Bax基因的表达，进而抑制C2C12 细胞的增殖。

4 结论

本研究发现过表达UCP3 基因可以显著降低C2C12 细胞增殖速率并显著减少EDU 阳性细胞数，通过抑制细胞增殖基因PCNA和Ki67 的表达，促进细胞凋亡基因Bax和caspase3 的表达进而抑制C2C12 细胞的增殖。干扰UCP3 基因可以提高降低C2C12 细胞增殖速率并显著增加EDU 阳性细胞数，通过促进细胞增殖基因PCNA和Ki67的表达，抑制细胞凋亡基因Bax和caspase3 的表达进而促进C2C12 细胞的增殖。