中国广西地区格特隐球菌菌种复合体的基因型分析

李炳坤 黄春阳 李秀楹 郑艳青 潘开素 廖万清 曹存巍

(1.广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，南宁 530021； 2.南宁市第四人民医院，南宁 530023； 3.上海长征医院皮肤性病与真菌病研究所，上海 200003)

隐球菌是自然界中威胁人类和动物生命的真菌病原体[1]。通常是人体吸入空气中的孢子或者酵母细胞进而进入呼吸道，然后传播到中枢神经系统，引起肺隐球菌病和隐球菌脑膜脑炎[2-3]。既往有大量的分子生物学方法已经证明在隐球菌中存在相当大的遗传异质性，且各种分子生物学技术已被用于隐球菌的基因分型研究，包括 PCRM13指纹分析、 AFLP、RAPD、 MLMT、多位点序列分型(MLST)和二代测序(NGS)分析[3-4]。格特隐球菌菌种复合体分为C.gattiisensustricto(AFLP4/VGI),C.deuterogattii(AFLP6/VGII),C.bacillisporus(AFLP5/VGIII),C.tetragattii(AFLP7/VGIV) andC.decagattii(AFLP10/VGIV)[5]。

隐球菌病主要由新生隐球菌和格特隐球菌菌种复合体感染所致，由新生隐球菌感染引起的隐球菌病全国各地均有发生，而格特隐球菌菌种复合体感染所致的隐球菌病最初被认为是一种地方性疾病，好发于热带地区。近年来格特隐球菌菌种复合体感染在我国报道逐年增多[6]，然而其相关研究的数据比较少，这些分离株的遗传同一性和变异性，以及临床分离株和全球分离株之间的系统发育关系还有待进一步研究。本研究旨在进一步了解广西地区格特隐球菌菌种复合体的基因型，并分析它们与全球菌株的亲缘关系以及相应的抗真菌药物敏感性。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

选取2014—2018年从临床患者收集的120株隐球菌菌株，其中10株分离自广西医科大学第一附属医院，另外1株分离自广西壮族自治区人民医院。利用CGB培养基筛选出的11株格特隐球菌菌种复合体作为本研究的研究对象，体外抗真菌药敏实验质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019 由北京大学真菌与真菌病研究中心惠赠。

1.2 MLST和系统发育分析

使用新型植物基因组DNA提取试剂盒(CWBIO，中国北京)提取菌株DNA。参考ISHAM共识的MLST方案，扩增并测序了7个基因座，包括CAP59、GPD1、LAC1、IGS1、PLB1、SOD1和URA5基因[7]。对等位基因进行了分析，并根据MLST数据库确定STs (http://mlst.mycologylab.org)。通过比对7个串联核苷酸序列(CAP59、GPD1、LAC1、IGS1、PLB1、SOD1和URA5)，分析格特隐球菌菌种复合体的系统发育[8]。使用MEGA7分析中国临床菌株和不同国家菌株之间的遗传关系[8-10]，使用最大似然法和1000个重复的自举分析生成系统发育树[11，12]。

1.3 主成分(PCA)分析

利用Adegene 2.1.1软件包R(3.4.4版)，将本研究中的格特隐球菌(AFLP4/VGI和AFLP6/VGII)与公开数据库的格特隐球菌进行聚类分析，以探索菌株的遗传关系和地理模式。

1.4 体外抗真菌药敏实验

依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐使用的微量肉汤稀释法M27-A3方案测定临床分离的格特隐球菌菌种复合体对氟康唑(FLC)、两性霉素B(AMB)、5氟胞嘧啶(5FC)、伊曲康唑(ITC)、伏立康唑(VOR)和泊沙康唑(POS)以及艾沙康唑(ISA)等抗真菌药的最小抑菌浓度(MIC)。每个菌株在不同的时间重复3次实验。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0进行统计分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 格特隐球菌菌种复合体感染患者临床资料

11名临床患者中。其中有10名隐球菌脑膜炎(CM)和1名肺隐球菌病(PC)患者。男女比例为8∶3，平均年龄为38.0±7.8岁(29～54岁)，职业以农民为主。10例CM患者中，常见的临床表现为头痛、发热、呕吐和恶心。PC(GX0717)患者以胸痛为主要症状。只有1名患者(GX0080)既往诊断为系统性红斑狼疮(SLE)，并接受了皮质类固醇治疗。然而，其他患者没有检测到显著的免疫异常。所有患者均无中国境外旅行史。

根据美国传染病学会(IDSA)指南和中国专家对隐球菌性脑膜炎诊断和治疗的共识，诱导期经过2种(AMB和FLC)或3种(AMB、FLC和5FC)抗真菌药物的联合治疗，多数患者症状明显缓解。尽管进行了抗真菌治疗，但仍有1名患者因无明显改善而放弃治疗后死亡(GX0147)。

2.2 MLST和系统发育分析

通过对11株格特隐球菌菌种复合体的MLST分析，发现5株为AFLP4/VGI，6株为AFLP6/VGII (见图1、2，见表1)。在AFLP4/VGI和AFLP6/VGII中分别检测到5种和3种不同的序列类型(STs)，所有的AFLP4/VGI菌株在遗传上是不同的(见图1)，其中GX0079与其他的AFLP4/VGI菌株有显著差异。而AFLP6/VGII分离株分为三大类群(ST169、ST129、ST309)，ST169和ST129均有1个以上的分离株(表1)。

图1 最大似然法构建中国广西11株格特隐球菌菌种复合体(蓝色)与18株参考菌株的系统发育树，图中每个分支的 bootstrap支持度均高于70% 图2 最大似然法构建中国广西6株AFLP6/VGII基因型的格特隐球菌菌种复合体(红色)与全球AFLP6/VGII基因型格特隐球菌菌种复合体的系统发育树。标准参考菌株C. gattii s.s.(WM179), C. bacillisporus(WM161), C. tetragattii(WM779)和C. decagattii(IHEM14941)为外群。加拿大及美国西北太平洋西地区暴发感染的菌株呈蓝色。图中分支的 bootstrap支持度高于70%用粗体表示

表1 中国广西地区临床分离的格特隐球菌菌种复合体序列类型、基因型

通过对我国和全球AFLP6/VGII分离株遗传分析表明，中国4个分离株(GX0104、GX0105、GX0147和GX0476)与来自巴西的AFLP6/VGII菌株(LMM293和ILA3279)聚类分布; 临床分离株(GX0903和GX0717)与来自西班牙(CCA242OLD)、新加坡(DF12341)、美国(B8973)和法国(IP2003/125)等地区的AFLP6/VGII菌株聚类分布，表明这些菌株之间在遗传上具有更近的亲缘关系。尽管这些分离株没有与在加拿大和美国的暴发中报道的高毒力菌株(AFL6A/VGIIa R265和AFL6C/VGIIc A6M-R38)高度相似，但系统发育树显示，GX0476菌株与来自美国俄勒冈州的AFL6C/VGIIc(A6M-R38)群体为姊妹关系。

2.3 中国和全球分离株的比较

基于多位点序列分型的的主成分分析(PCA)用于评估中国和全球分离株之间的遗传关系。数据显示AFLP4/VGI中存在大约41.8%的遗传变异性(PC1 30.0%，PC2 11.8%，见图3)。AFLP6/VGII 为35%的遗传变异性 (PC1 17.9%，PC2 17.1%，见图4)，且在AFLP6/VGII分离株中，4个AFLP6/VGII分离株似乎来自南美洲。以上主成分分析未按来源对格特隐球菌菌种复合体进行分组，这与系统发育分析的结果相一致。

2.4 抗真菌药物敏感性

表2的MICs显示，所有菌株对常用抗真菌药物均无耐药性。根据临床疗效，AMB、FLC和5FC的2种或3种药物联合治疗是有效的。AFLP4/VGI和AFLP6/VGII菌株对这7种抗真菌药物敏感性无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

我们的研究表明，中国广西地区的格特隐球菌菌种复合体感染是由C.gattiis.s. (AFLP4/VGI)和C.deuterogattii(AFLP6/VGII)引起，且拥有不同的MLST基因型。尽管本次研究的AFLP6/VGII与暴发的高毒力基因型AFL6A/VGIIa(R265)和AFL6C/VGIIc(A6M-R38) 在基因上并不完全相似，但它们与全球其他AFLP6/VGII菌株有亲缘关系，例如巴西(LMM293和ILA3279)、新加坡(DF12341)和西班牙(CCA242OLD)。AFLP6/VGII菌株基因组具有遗传多样性，并且在C.deuterogattii菌株的亚基因型(AFLP6A/VGIIa和AFLP6C/VGIIc)中存在较大的基因型变异性，特别是巴西的AFLP6/VGII菌株[14]，虽然本研究的样本量小，但大多数格特菌株在遗传上呈多样性。这种可变性可能是由于特殊的生态相互作用、适应和进化机制所致。隐球菌物种能够适应不同的生态位和温度，它们可以通过微进化，进而在宿主和环境中适应[15]。

本研究的临床数据显示，除了1名系统性红斑狼疮患者外，几乎所有患者均无明显的免疫缺陷，这与以往报道的格特隐球菌菌种复合体通常感染具有免疫活性宿主这一观点是一致的[6]。大多数患者在联合治疗后明显缓解，1名患者(GX0147)因无明显改善而放弃治疗后去世。然而，抗真菌药物敏感性试验表明，本研究中的菌株对抗真菌药物没有耐药性，最低抑菌浓度值均在敏感范围内[16-18]。提示这些菌株未表现出耐药性，但其他因素可能影响治疗效果。

图3 中国广西地区AFLP4/VGI菌株和全球的AFLP4/VGI菌株的主成分分析图 图4 中国广西地区AFLP6/VGII菌株和全球的AFLP6/VGII菌株的主成分分析图

表2 中国广西地区11株格特隐球菌菌种复合体的抗真菌药物敏感实验

隐球菌可以通过树木和木材产品的进出口、气流、水流、及生物源(如鸟类)等传播[19]。与常见于野生/宠物鸟类粪便(尤其是鸽子粪便)及其污染的土壤中的新生隐球菌不同，格特隐球菌菌种复合体更喜欢生长在潮湿的树皮、树洞和野生树木(包括桉树等)附近的土壤[20]。风和气流传播格特隐球菌菌种复合体的证据是有限的，但是在加拿大和印度的阳性树木周围空气样本中分离出真菌[19]。广西位于中国南部，属亚热带湿润季风气候[21]，可能有利于格特隐球菌菌种复合体的生长和繁殖。在这项研究中，大多数患者是农民，且都接触过上述植物和土壤(尤其是桉树)，但都没有前往格特隐球菌菌种复合体流行区域的旅行史(主要是加拿大、南美和澳大利亚等的流行区)，这表明他们的隐球菌感染是接触当地环境而导致的[23]。广西格特隐球菌菌种复合体的遗传多样性也表明了多重独立起源的可能性。结合本研究的系统发育分析，我国部分菌株与巴西菌株有亲缘关系。这可以追溯到从其他地方进口的木材/幼苗，如南美洲和澳大利亚[23]。但仍需要从树木、土壤和野生动物的环境中进一步分离和调查，以明确广西格特隐球菌菌种复合体的感染源。

在全球范围内，与新生隐球菌感染相比，格特隐球菌菌种复合体感染相对较少(11.4%VS88.6%)[24]，然而，最近的研究表明，该菌的感染经常被误诊或漏诊[25]。同样，其在中国的感染数量也可能被低估。与国内其他省份的数据相比[26-27]，广西格特隐球菌菌种复合体感染发生率约为9% (11/120)，大部分感染是由AFLP6/VGII引起的，因此，这需要进行更多的流行病学调查和研究。