绵羊TIMP1基因克隆及真核表达载体的构建

宋芳婷，李 冉，李闰婷，聂晓宁，侯 雯，张丽萌

(郑州师范学院分子生物学实验室，河南 郑州 450044)

0 引言

组织金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是金属蛋白酶的内源性抑制剂，在各种细胞中均有表达，主要作用于调节基质金属蛋白酶活性和抑制细胞外基质的转化，包括参与调节细胞增殖、细胞分化、侵袭及细胞凋亡等过程[1]。迄今为止哺乳动物TIMPs家族共有4个成员，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，在结构上均具有2个结构域，其中TIMP1最初是以胶原酶抑制剂的形式在体外培养的人皮肤成纤维细胞、人血清以及牛软骨和兔骨中分离发现的，可抑制所有胶原酶的活性，是TIMPs家族中的一个重要基因[2-3]。

有研究显示，TIMP1基因能够作用于小鼠子宫和卵巢组织，从而参与调控小鼠的生殖周期，另外还可作为一种类固醇生成的调节剂。在山羊的研究中发现TIMP1基因可以增加输卵管上皮细胞的增殖，表明TIMP1基因在促进输卵管上皮细胞的存活中可发挥重要作用[4]。有研究表明，TIMP1主要在卵泡中表达，能够促进细胞增殖、凋亡和激素合成。因此，初步推测在绵羊生产中TIMP1基因可能会对其繁殖性状存在一定的影响，并且目前TIMP1基因调控卵泡发育的分子机制尚不明确。鉴于此，本研究以绵羊卵巢为研究对象，通过分析TIMP1基因不同发育时期卵巢中的表达差异及构建表达载体，为进一步深入研究其生物学功能及在卵泡发育中的作用机制奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料和菌株

绵羊卵巢组织、pEGFP-C1载体、DH5α感受态细胞、HEK293F细胞株由郑州师范学院分子生物学实验室提供。

1.2 主要试剂

Trizol、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶NheⅠ和EcoRⅠ，购自NEB公司；Pfu酶、质粒小提试剂盒、DMEM、0.25%胰酶、ReverAid First Strand cDNA synthesis kit，均购自全式金生物技术有限公司；HRP标记的His单克隆抗体购自武汉三鹰；Green Taq Mix聚合酶、同源重组试剂盒购自南京诺唯赞公司；Opti-MEM、胎牛血清(FBS)均购自BI公司。

1.3 引物设计和合成

根据NCBI数据库中绵羊TIMP1基因的编码序列，设计特异性引物TIMP1-PF 5′-AGAATTCGAAGCTTGAGCTATGGCCCTCTTTGCACC-3′；TIMP1-PR 5′- CCTAGGTGGCCTAGATCTCGCCCCCCGGGGCCG-3′，由上海生工合成。

1.4 卵巢组织RNA的提取和反转录

利用TRIzol法提取不同发育时期(产多胎和产单胎)的绵羊卵巢组织的RNA，并进行纯度的测定，参考TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明进行反转录成cDNA。

1.5 荧光定量PCR

为明确TIMP1在不同卵巢组织中的差异表达，以反转录产物cDNA为模板，然后进行RT-PCR扩增。反应体系(10 μL)如下：cDNA 1 μL、上游和下游引物各1 μL、SYBR Green PCR mix 5 μL、Rnase-Free H2O 3.6 μL。 PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 15 s，共45个循环；60℃～95℃，每循环增加0.5制作熔解曲线。每个反应体系设3个重复，由PCR扩增曲线得到Ct值。

1.6 重组载体pEGFP-C1-TIMP1的构建

以反转录产物cDNA为模板，利用Pfu酶进行PCR扩增TIMP1基因，克隆至pMD18-T载体，转化至DH5α感受态细胞并送测序。将EcoRI/BamHI双酶切后的产物连接至pEGFP-C1线性化载体，37℃连接30 min，转化至DH5α感受态细胞，涂布于LB平板后挑取单菌落进行测序鉴定。

1.7 细胞转染

提取真核表达质粒pEGFP-C1-TIMP1，转染至生长状态良好的HEK293F细胞，同时以空载体质粒作为阴性对照。48 h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取及差异分析

利用Trizol法提取的RNA测得OD260/280 nm值为1.8～2.0，说明提取总RNA质量较好，可用于RT-PCR扩增。采用RT-PCR技术对绵羊不同卵巢组织TIMP1基因的表达量进行了定量分析。按照2-△△Ct法计算出TIMP1基因在绵羊不同卵巢组织的相对表达量。结果表明，TIMP1基因在不同卵巢组织中均能被检测到，在产多胎中的绵羊卵巢组中表达量最高。

2.2 TIMP1基因的克隆

以提取的绵羊卵巢组织反转录产物cDNA为模板，通过RT-PCR成功扩增获得绵羊TIMP1基因，大小约669 bp(见图1)，与预期结果大小一致。

M—Trans2K® Plus DNA Marker；1—TIMP1基因扩增产物

2.3 PCR菌落鉴定

挑选平板上的克隆进行PCR菌落鉴定，扩增大小为669 bp，选择鉴定正确的克隆送测序，经测序分析后确定与GenBank中预测的基因序列同源性为100%。

2.4 TIMP1蛋白表达检测

将重组质粒pEGFP-C1-TIMP1利用Lipofectamine2000瞬时转染至HEK293F细胞，过表达48 h后在荧光显微镜下观察到细胞有绿色荧光，表明pEGFP-C1-TIMP1真核表达载体构建成功，并且能在HEK 293细胞中正常表达。

3 讨论

随着养殖业集约化生产，产羔性状成为重要的繁殖性状，与养殖业的经济效益息息相关，因此提高产羔数对养殖业的发展至关重要。卵巢组织在生殖过程中起着重要作用，影响发情、卵泡发育和排卵等[5]。本研究中，以绵羊卵巢组织为材料，利用RT-PCR技术检测在不同组卵巢组中TIMP1基因的表达水平。结果显示，TIMP1基因在多胎绵羊卵巢组织的表达量显著高于单胎组，这表明TIMP1基因的表达有可能影响绵羊的卵巢功能。目前TIMP1基因在调控卵泡发育的分子机制尚不明确，因此该基因对绵羊卵泡发育的调控作用机制还有待深入研究。

在研究中最常用的基因功能研究方法包括过表达和干扰RNA技术，其中过表达主要通过克隆构建来实现基因产物的超表达[6]，本研究中选择pEGFP-C1载体进行过表达载体的构建，通过脂质体转染至细胞中后可能表达绿色荧光蛋白，在显微镜下通过观察绿色荧光来判断TIMP1蛋白的表达情况。刘同君[7]等通过构建GRP78基因超表达载体从而阐明了该基因在免疫调控方面的新功能。因此，本研究通过构建过表达质粒pEGFP-C1-TIMP1并在HEK293F细胞中进行表达，通过构建绵羊TIMP1基因的真核表达载体可为后期研究该基因的重要功能等方面提供试验基础，为进一步探究其对绵羊产羔性状的调控机理提供试验基础。