miR-204-3p靶向CYP2E1介导脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤

朱志伟 郑培明 王荣

脂多糖（lipopolysacharide，LPS）可加重肾小管上皮细胞炎症反应并可促进疾病发生及发展［1］。研究表明miR-204-3p 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中表达下调，miR-204-3p 过表达可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤［2］。生物信息学分析显示细胞色素P450 家族2 亚家族E 成员1（Cytochrome P450 2E1，CYP2E1）可能是miR-204-3p 的靶基因，研究表明CYP2E1 在酒精性胰腺炎中表达上调并可参与该疾病发生过程［3］。但miR-204-3p 是否可通过靶向调控CYP2E1 的表达而影响肾小管上皮细胞损伤尚未可知。因此，本研究通过LPS 诱导肾小管上皮细胞，探讨miR-204-3p 对肾小管上皮细胞炎症反应及细胞凋亡的影响，分析其对CYP2E1 的靶向调控作用，为进一步揭示肾小管上皮细胞损伤的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人肾小管上皮细胞HK-2 购自上海基尔顿生物；LPS 购自北京百奥莱博科技有限公司；Lipofectamine2000 购自美国Thermo Fisher 公司；miR-204-3p mimics 及阴性对照miR-NC、si-CYP2E1、si-NC、anti-miR-204-3p 购自广州锐博生物；pcDNA3.1 购自上海柯雷生物；Trizol 试剂购自美国Invitrogen；反转录试剂盒与实时荧光定量PCR 试剂盒购自大连宝生物；IL-6、TNF-α 检测试剂盒购自南京建成生物；细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma；兔抗人CYP2E1 抗体购自上海生工生物；兔抗人Bcl-2、Bax 抗体购自美国CST 公司；二抗购自美国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

肾小管上皮细胞（2×105个/mL）接种于6 孔板（150 μL/孔），加入含有10 μg/mL LPS 的培养液处理24 h［4］，记作LPS组。同时将未经处理的细胞作为Con组。分别将miR-NC、miR-204-3p mimics、si-NC、si-CYP2E1、miR-204-3p mimics 与pcDNA、miR-204-3p mimics 与pcDNA-CYP2E1 转染至肾小管上皮细胞48 h，加入含有10 μg/mL LPS的培养液处理24 h，分别记作LPS+miR-NC 组、LPS+miR-204-3p 组、LPS+si-NC 组、LPS+si-CYP2E1 组、LPS+miR-204-3p+pcDNA 组、LPS+miR-204-3p+pcDNA-CYP2E1 组。

1.2.2 qRT-PCR 检测细胞中miR-204-3p、CYP2E1 mRNA 的表达水平

收集各组肾小管上皮细胞，采用Trizol 法提取细胞中的总RNA。参照反转录试剂盒将RNA 合成cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，根据试剂盒说明书配置反应体系，采用2-ΔΔCt法计算miR-204-3p、CYP2E1 mRNA 的相对表达量。

1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-6、TNF-α的水平

收集各组肾小管上皮细胞培养上清液，采用ELISA 法检测IL-6、TNF-α 的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集各组肾小管上皮细胞，预冷PBS 洗涤，加入500 μL Binding Buffer 悬浮细胞，依次分别加入5 μL Annexin V-FITC 与5 μL PI，充分混匀，室温避光孵育20 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-204-3p 的靶基因

构建野生型载体WT-CYP2E1、突变型载体MUT-CYP2E1，分别将miR-NC、miR-204-3p mimics 与WT-CYP2E1、MUT-CYP2E1 共转染至肾小管上皮细胞，转染48 h 后加入双荧光素酶报告基因检测试剂盒相关试剂，按说明书操作检测荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot 检测CYP2E1、Bcl-2、Bax 蛋白表达

RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，取30 μg 变性蛋白进行SDS-PAGE，转膜，采用5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗稀释液（1∶1 000），孵育二抗稀释液（1∶2 000），滴加ECL，曝光，显影，应用ImageJ 软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据；计量资料以（±s）表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的肾小管上皮细胞中的表达

LPS 组细胞中miR-204-3p 的表达水平降低，CYP2E1 mRNA 及蛋白表达量显著升高，与Con 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 CYP2E1 蛋白表达Figure 1 The expression of CYP2E1 protein

表1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的肾小管上皮细胞中的表达（±s，n=9）Table 1 The expression of miR-204-3p and CYP2E1 in renal tubular epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表1 miR-204-3p 和CYP2E1 在脂多糖刺激的肾小管上皮细胞中的表达（±s，n=9）Table 1 The expression of miR-204-3p and CYP2E1 in renal tubular epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分组Con LPS t 值P 值miR-204-3p 1.01±0.09 0.58±0.05 12.530 0.000 CYP2E1 mRNA 0.99±0.08 3.01±0.29 20.144 0.000 CYP2E1 蛋白0.42±0.04 0.83±0.07 15.256 0.000

2.2 miR-204-3p 过表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响

与Con 组比较，LPS 组IL-6、TNF-α 水平、凋亡率及Bax 蛋白水平升高，Bcl-2 蛋白水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与LPS+miR-NC 组比较，LPS+miR-204-3p 组IL-6、TNF-α 水平、凋亡率及Bax 蛋白水平降低，Bcl-2 蛋白水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、表2。

图2 miR-204-3p 过表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响Figure 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide

2.3 抑制CYP2E1 表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响

与LPS+si-NC 组比较，LPS+si-CYP2E1组IL-6、TNF-α水平、凋亡率及Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、表3。

图3 抑制CYP2E1 表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响Figure 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide

表2 miR-204-3p 过表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响（±s，n=9）Table 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表2 miR-204-3p 过表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响（±s，n=9）Table 2 The effect of miR-204-3p overexpression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分组Con LPS LPS+miR-NC LPS+miR-204-3p F 值P 值miR-204-3p 1.00±0.05 0.57±0.05 0.55±0.06 0.81±0.07 122.022 0.000 IL-6（ng/mL）3.45±0.36 15.24±1.53 16.22±1.74 6.21±0.62 251.116 0.000 TNF-α（ng/mL）1.74±0.17 8.36±0.83 8.57±0.81 3.55±0.36 283.598 0.000凋亡率（%）6.58±0.66 27.32±2.71 29.65±2.84 11.02±1.13 280.387 0.000 Bcl-2 蛋白0.67±0.06 0.25±0.03 0.23±0.03 0.59±0.05 236.203 0.000 Bax 蛋白0.30±0.03 0.78±0.07 0.79±0.06 0.38±0.03 234.495 0.000

表3 抑制CYP2E1 表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响（±s，n=9）Table 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

表3 抑制CYP2E1 表达对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达和凋亡的影响（±s，n=9）Table 3 The effect of inhibiting CYP2E1 expression on the expression of inflammatory factors and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by lipopolysaccharide（±s，n=9）

分组Con LPS LPS+si-NC LPS+si-CYP2E1 F 值P 值CYP2E1 蛋白0.41±0.04 0.85±0.07 0.87±0.08 0.50±0.05 131.123 0.000 IL-6（ng/mL）3.65±0.35 16.34±1.63 17.02±1.69 8.32±0.81 267.156 0.000 TNF-α（ng/mL）1.98±0.19 8.92±0.88 9.01±0.89 5.69±0.54 210.345 0.000凋亡率（%）7.02±0.71 28.41±2.84 28.69±2.88 13.58±1.37 227.065 0.000 Bcl-2 蛋白0.66±0.06 0.24±0.03 0.22±0.03 0.53±0.05 215.506 0.000 Bax 蛋白0.31±0.03 0.76±0.07 0.77±0.07 0.42±0.04 162.049 0.000

2.4 miR-204-3p 靶向调控CYP2E1 的表达

TargetScan 预测显示CYP2E1 的3'UTR 中含有与miR-204-3p 互补的核苷酸序列，见图4。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-204-3p过表达可降低WTCYP2E1 的荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。miR-204-3p 负向调控CYP2E1的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5、表5。

图4 CYP2E1 的3'UTR 中含有与miR-204-3p 互补的核苷酸序列Figure 4 The 3'UTR of CYP2E1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-204-3p

表4 双荧光素酶报告实验检测结果（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase report test results（±s，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验检测结果（±s，n=9）Table 4 Dual luciferase report test results（±s，n=9）

分组miR-NC miR-204-3p t 值P 值WT-CYP2E1 1.03±0.07 0.61±0.06 13.667 0.000 MUT-CYP2E1 1.05±0.06 1.02±0.08 0.900 0.381

3 讨论

图5 CYP2E1 蛋白表达Figure 5 The expression of CYP2E1 protein

表5 miR-204-3p 调控CYP2E1 蛋白的表达（±s，n=9）Table 5 miR-204-3p regulated the expression of CYP2E1 protein（±s，n=9）

表5 miR-204-3p 调控CYP2E1 蛋白的表达（±s，n=9）Table 5 miR-204-3p regulated the expression of CYP2E1 protein（±s，n=9）

分组miR-NC miR-204-3p anti-miR-NC anti-miR-204-3p F 值P 值CYP2E1 蛋白0.43±0.04 0.21±0.02 0.42±0.04 0.86±0.07 315.388 0.000

miR-204-3p 通过调节乳酸脱氢酶介导的糖酵解而抑制膀胱癌细胞增殖［5］。研究表明miR-204-3p 通过靶向Braykinin B2 受体而减轻高糖诱导的MPC5 足细胞凋亡［6］。相关报道指出miR-204-3p可调控甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡等生物学行为［7］。本研究结果显示LPS 诱导的肾小管上皮细胞中miR-204-3p 的表达量降低。IL-6、TNF-α 水平升高可促进体内炎症反应的发生从而促使疾病进展［8］。本研究结果显示LPS 处理后IL-6、TNF-α 水平升高，而miR-204-3p 过表达可显著减低IL-6、TNF-α水平，提示miR-204-3p 过表达可减轻LPS 诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤。本研究结果显示LPS 处理后肾小管上皮细胞凋亡率升高，而miR-204-3p过表达可抑制细胞凋亡，提示miR-204-3p 过表达可抑制LPS 诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

CYP2E1 在高糖诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞损伤中表达增加，槲皮素通过抑制CYP2E1表达减轻高糖诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞损伤［9］。CYP2E1 在酒精性肝病大鼠模型的肝组织中表达增强，抑制CYP2E1 可减轻脂质过氧化反应［10］。本研究结果显示LPS 诱导的肾小管上皮细胞中CYP2E1 表达上调，进一步分析显示抑制CYP2E1 表达后IL-6、TNF-α 水平降低，细胞凋亡率降低，提示抑制CYP2E1 表达可抑制LPS 诱导的肾小管上皮细胞炎症反应及细胞凋亡。本研究证实miR-204-3p 能够靶向结合CYP2E1，CYP2E1 过表达可减弱miR-204-3p 过表达对LPS 诱导的肾小管上皮细胞炎症因子表达及凋亡的作用。

综上所述，LPS 诱导的肾小管上皮细胞中miR-204-3p 表达下调，CYP2E1 表达上调，miR-204-3p过表达可抑制LPS 诱导的肾小管上皮细胞炎症反应及细胞凋亡，其作用机制可能与靶向调控CYP2E1 的表达有关，可为急性肾损伤等肾脏疾病的诊断及治疗提供科学依据。