肿瘤突变负荷位点检测准确性评价

孙楠 于婷 张文新 贾峥 黄杰 曲守方

肿瘤免疫治疗是通过激发或调动机体自身的免疫系统，解除肿瘤细胞对于自身免疫系统的抑制，达到调控和杀伤肿瘤细胞的目的。免疫治疗这种全新的治疗模式也为肿瘤患者带来了新的机遇。其中免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitor，ICI）给恶性肿瘤治疗带来了新的选择，包括程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂及其配体（PDL1）抑制剂，以及细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抑制剂等［1-2］。肿瘤突变负荷（tumour mutation burden，TMB）是预测患者对免疫检查点抑制剂治疗反应的新兴生物标志物，识别可能受益于免疫治疗的肿瘤患者［3-4］。已有研究表明，与低TMB 相比，高TMB 患者的免疫治疗效果更好［5-6］。

常见的TMB 检测方法是对肿瘤组织切片或血液标本进行高通量测序（Next-generation sequencing，NGS），包括全外显子（Whole Exome Sequencing，WES）测序和试剂盒（Panel）靶向测序等方法［7-8］。虽然肿瘤组织全外显子测序是公认的检测TMB 的金标准，但其测序成本较高、周期长，并且对肿瘤组织标本大小和肿瘤细胞含量有较高要求，在临床实践中难以广泛使用。国内外有多家体外诊断试剂公司都在二代测序平台上开发了TMB 检测试剂盒（Panel），用经过验证的panel 算法来计算TMB，期望替代全外显子测序。中国食品药品检定研究院（简称中简院）建立肿瘤突变负荷检测（TMB）国家参考品，包括高置信单核苷酸多态性和插入缺失（Single nucleotide polymorphisims/insertion-deletion，SNP/Indel）位点标准集，用来考察试剂盒（Panel）的位点检测准确性。

1 材料与方法

1.1 样本

肿瘤突变负荷检测国家参考品由简称中检院提供。

1.2 试剂与仪器

核酸纯化试剂和TMB 检测试剂盒（可逆末端终止测序法），购自南京世和医疗器械有限公司；KAPA Library Quant Kit（illumina）Universal qPCR Mix，购自KAPA Biosystems 公司；测序试剂盒，购自Illumina 公司。超声破碎仪，购自Diagenode 公司；Qubit®4.0 荧光定量仪，购自Life Technology 公司；Nextseq 550 DX 测序仪，购自Illumina 公司。

1.3 方法

肿瘤突变负荷检测国家参考品中TMB-14 样本，是来自不同人体且是非肿瘤组织的1 对细胞系。将这对细胞按照不同体积比例进行混合，1 个细胞（TMB-H）基因组DNA 所占的体积比例分别为0%、1%、2%、5%和10%，其配对细胞（TMB-BL）基因组DNA 所占的体积比例分别为100%、99%、98%、95%和90%。取不同体积比例的TMB-14 样本基因组DNA，用TMB 检测试剂盒（可逆末端终止测序法）进行检测。基因组DNA 经超声片段化处理，进行末端修复和文库接头连接。将文库扩增后进行杂交捕获富集，洗脱掉未富集的片段后进行扩增。最后将标准化文库上机测序。下机后按照国家参考品说明书，根据panel 检测的bed 文件，将试剂盒panel 检测的VCF 文件与TMB-14 样本的高置信SNP/Indel 位点标准集进行比对分析，评价肿瘤突变负荷位点检测准确性。

2 结果

panel 检测的VCF 文件与标准集比对后，TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%的突变检测准确性分别为89.00%、95.20%、95.80%，符合TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%国家参考品应分别不低于40%、60%、80%的要求。TMB-14 样本的高置信SNP/Indel 位点标准集和试剂盒panel 检测的SNP/Indel 位点比对。见表1、图1～2。

表1 TMB 检测国家参考品结果Table1 ResultsofnationalreferencematerialforTMBdetection

图1 国家参考品高置信SNP 位点标准集与试剂盒SNP的比对结果Figure 1 Comparison results of high confidence SNP site standard set in the national reference material and SNP by kit

图2 国家参考品高置信Indel 位点标准集与试剂盒Indel比对结果Figure 2 Comparison results of high confidence Indel site standard set in the national reference material and Indel by kit

3 讨论

随着二代测序技术的不断发展，对肿瘤治疗理念的创新，从肿瘤的分型逐渐引入了分子分型的理念，重视肿瘤的分子靶向治疗，实现异癌同治、同癌异治，美国食品和药物管理局（FDA）突破性的批准了泛癌种的二代测序技术的肿瘤基因突变检测panel。2017年11月30日美国FDA 批准上市FoundationOne CDx 伴随诊断产品，针对324 个基因进行检测，检测的突变类型包括替换、插入、缺失、拷贝数变化、基因重排等突变，以及微卫星不稳定性（MSI）和TMB 检测，适用的样品类型为福尔马林固定石蜡包埋组织样本（FFPE）［9-11］。但是我国尚未批准用于TMB 检测的伴随诊断试剂产品。我国已经有多个公司在NGS 平台上开发TMB 检测试剂盒，但是至今尚未进入审批阶段。目前TMB 缺乏统一的检测标准，研制相应的国家参考品，开展TMB 相关应用技术以及标准化研究，可以为TMB 检测试剂的申报奠定工作基础。

2019年中检院建立TMB 检测国家参考品，开展国内TMB 试剂盒（panel）的性能评价工作。对于TMB 检测试剂盒的性能，应关注于两个方面：一是试剂盒（panel）的TMB 检测一致性，panel 的TMB 检测结果与WES 检测结果的一致性，考察其检测TMB 准确性；二是试剂盒的差异性SNP/Indel位点检测准确性评价，检测SNP/Indel 位点标准集时能够拷出的合适的突变位点个数，考察试剂盒整体检测的准确性，从而对TMB 检测试剂盒的性能进行全方位的评价。

而评价TMB 试剂盒（panel）的位点检测准确性，需要与高置信SNP/Indel 位点标准集进行比对。美国的瓶中基因组协会（Genome In A Bottle，GIAB）采用五种不同平台对美国国家标准技术研究所提供的DNA 标准参考品8392（又称NA24385，HG002）进行结构变异标准集构建［12-13］。参考国际建立标准集的方式，本院建立国家参考品高置信SNP/Indel 位点标准集。首先使用软件SOAPnuke对所有原始数据进行低质量过滤得到有效数据，使用软件BWA+GATK Haplotype Caller 对各数据集分别进行变异检测，得到两类文件：（a）gVCF，用于生成候选变异区间（b）VCF，用软件GATK VQSR进行处理，初步过滤得到候选变异集。然后合并各平台的候选变异集，使用软件vcf annotate 将各候选变异区间注释到合并的变异集上。对于每一个候选变异集，随机取40 000 个在候选变异区间内的变异位点作为训练集，使用R 语言包“e1071”中的软件one-class SVM 进行分类，得到各候选变异集的极端变异阈值用于变异筛选。对于未通过筛选的变异，在其两侧加减50 碱基（bp），生成低置信变异区间。最后合并候选变异区间，与低置信变异区间取补集，再与参考基因组非N 区间取交集，从而建立了TMB-14 样本的两种细胞系有差异的高置信SNP/Indel 位点标准集。研究结果表明panel 检测的VCF 文件与标准集比对后，TMB-14-2%、TMB-14-5%、TMB-14-10%的突变检测准确性符合国家参考品TMB-14 样本的要求。研制的TMB 国家参考品，能够满足肿瘤突变负荷检测试剂盒的位点检测准确性的要求，具有重要的应用价值。