木犀草素纳米乳对DPPH·自由基的清除活性研究

胡泽香， 佟 雷， 耿艳萌， 杨 琦， 谢 舒， 侯甲福*

(1.牡丹江医学院 药学院，黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江医学院 公共卫生学院，黑龙江 牡丹江 157011)

木犀草素(luteolin, Lut)是一种3'，4'，5，7-四羟基黄酮类化合物，在自然界中分布非常广泛，在十字花科、天南星科、伞形科、菊科、唇形科等药物中均有分布，例如,菊花、荆芥、白毛夏枯草、洋蓟等天然药物。此外，一些常规蔬菜如芹菜、甜椒中也含有木犀草素。木犀草素因其丰富的生物药理活性得到人们的关注，相关研究表明，木犀草素具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制肥胖、缓解Ⅱ型糖尿病等多种药理活性。而木犀草素发挥抗肿瘤、抑制肥胖、缓解Ⅱ型糖尿病等生理活性的基础则是抗氧化活性。

有研究表明，黄酮类化合物的抗菌、抗炎、抗过敏等作用与其具有的抗氧化活性有很大关系。黄酮类化合物是一种O捕捉剂和O猝灭剂，这是由其化学结构决定的。此外，酚羟基的取代基位置和数目，都会影响黄酮类化合物的抗氧化性，尤其是B环的邻二酚羟基，可以大大增强其抗氧化活性。

木犀草素作为黄酮类化合物，也应该具有一定的抗氧化能力。本研究主要从木犀草素纳米乳清除DPPH·自由基方面来研究其抗氧化活性，并以Vc为对照，为木犀草素的抗氧化效果研究提供数据支持，为进一步研究其抗炎抗肿瘤等药理作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

药品与试剂：木犀草素(纯度≥98%，上海泰坦科技股份有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，飞净科研试剂)；无水乙醇(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；维生素C片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；Tween-80(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)。

主要仪器：紫外可见分光光度计；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；SHIMADZU电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；B-260水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 DPPH·自由基清除能力

DPPH·自由基中心的氮原子具有的孤对电子，波长在在517 nm时有吸收峰。当加入抗氧化剂时，孤对电子会与活性质子结合，最大波长处吸收会减弱或消失。IC是表征DPPH·自由基清除能力的一项指标，表示抑制50%的自由基所需抗氧化剂的浓度。IC数值越小，自由基的清除能力越强，则抗氧化性越强。本实验通过测定木犀草素纳米乳对DPPH·自由基清除IC值表征其抗氧化活性。

1.3 操作步骤

1.3.1 DPPH溶液配制 称取0.007 8 g DPPH，无水乙醇溶解后定容至100 mL，得浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液，现用现配，避光保存。

1.3.2 木犀草素纳米乳配制 将乙酸乙酯、蒸馏水、tween-80、无水乙醇4种组分按照相应比例加入烧杯中，加入2 mg木犀草素，搅拌混合之后共100 mL。用超声波细胞粉碎机进行超声，最终形成木犀草素纳米乳。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL木犀草素纳米乳置于试管，加入无水乙醇定容至2 mL，得到溶液的浓度分别为0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 mg/mL。

1.3.3 Vc溶液配制 准确称取5 mg的Vc粉末，蒸馏水溶解后定容至100 mL。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4 mL Vc溶液置于试管，加入蒸馏水定容至2 mL，得到溶液的浓度分别为0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 mg/mL。

1.3.4 木犀草素纳米乳清除率测定 分别取2 mL不同浓度的木犀草素纳米乳加入试管，再加入3 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，25 ℃避光条件下反应30 min。然后离心机离心10 min，速度为3 000 r/min。用无水乙醇作为参比，在517 nm处测其吸光度，平行测定3次，取平均值。

1.3.5 Vc清除率测定 分别取2 mL不同浓度的Vc溶液加入试管，再加入3 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，25 ℃避光条件下反应30 min。然后离心机离心10 min，速度为3 000 r/min。用蒸馏水作为参比，在517 nm 处测其吸光度，平行测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 木犀草素纳米乳的制备

将木犀草素与乙酸乙酯、蒸馏水、tween-80、无水乙醇混合，经过超声波细胞粉碎机超声，最终制备得到了澄清透明的木犀草素纳米乳。观察其体系呈淡黄色，色泽均一，无浑浊、分层及絮凝等现象，平均粒径为9.633 nm，多分散系数PDI为0.022， 属 O/W 型纳米乳液。

2.2 清除DPPH·自由基的能力测定

以Vc为对照，不同浓度的木犀草素纳米乳对DPPH·自由基的清除率如图1所示。清除DPPH·自由基实验是检验化合物抗氧化能力的常见方法，由图1可以看出木犀草素纳米乳对DPPH·自由基具有一定的清除作用，其清除作用效果与木犀草素纳米乳浓度在一定范围内呈正向关系，木犀草素纳米乳清除DPPH·自由基的能力稍弱于Vc。在0.002～0.014 mg/mL范围内，木犀草素纳米乳浓度越大，对DPPH·自由基的清除率也越高。

图1 木犀草素对DPPH·自由基的清除作用

3 结论与讨论

氧气在人类日常生活中是不可或缺的，但是当氧气与体内某些物质发生化学反应时，会生成对人类有害的活性氧和自由基。活性氧和自由基会破坏生物大分子的结构，引起DNA的突变，破坏生物大分子的的膜结构和功能蛋白,由此加速机体的老化和损伤，甚至会使癌症、恶性肿瘤的发生率增加。自由基含有未配对的电子，因此其结构很不稳定。若自由基在体内积聚过多会导致细胞损伤、衰老甚至死亡，使得心、脑等器官功能衰退，机体免疫防御能力降低。因此，木犀草素体外抗氧化能力的研究具有重要的意义与应用价值。木犀草素作为一种天然类黄酮化合物，其结构含有一定数目的酚羟基，使其具有较强的还原性，从而具有抗氧化特性。研究证实木犀草素可作为活性氧的清除剂，抑制活性氧并活化相关的抗氧化酶。木犀草素还作用于酶类抗氧化系统,增强机体内抗氧化酶系统的活性,对抗氧自由基、活性氧从而发挥抗氧化作用。

木犀草素在自然界广泛存在，以糖苷形式存在于多种植物中，并且具有多种药理活性，如果能将其生物活性发挥出来，将大大降低药物原材料成本，但是自身的理化性质影响了开发及应用。已有研究表明，木犀草素具有一定的供氢能力，提供的H与自由基相互结合，使其还原为惰性化合物或是形成稳定的自由基，从而可以清除机体内过多的有害自由基。本试验用DPPH法来验证木犀草素纳米乳是否具有抗氧化活性。实验结果表明，木犀草素纳米乳可有效的清除DPPH·自由基，其清除自由基能力很强，略弱于Vc溶液，表明木犀草素纳米乳具有很强的抗氧化活性。针对木犀草素纳米乳清除自由基的能力，说明木犀草素在抗氧化剂方面具有优秀的开发潜能，可以更好的应用于食品加工和医疗领域。