光果甘草愈伤组织中甘草定提取条件优化

苗永美， 王宇豪， 方 达， 汪 雁， 张 维

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

含植物成分的天然化妆品日益受到广大消费者青睐,当今社会掀起了研究该类植物的热潮。光果甘草(

Glycyrrhiza

glabra

L.)含有甘草定美白成分,是通过显著抑制酪氨酸酶活性和清除自由基达到美白肌肤功效,因对皮肤刺激或过敏性反应极少,是公认最安全祛斑美白成分,也是世界上最昂贵的天然祛斑美白成分,享有“美白黄金”称号;甘草定还具理化性质稳定,皮肤吸收能力强、用量少等特点。因此,光果甘草中的甘草定在化妆品领域具有很好市场潜力和应用前景。另有研究表明,甘草定能诱导细胞凋亡,对黑色素瘤、宫颈癌Hela细胞、肝癌Hep3B细胞的增殖有抑制作用;还能防治动脉样硬化、降血糖、抗菌杀菌等。

作为光果甘草愈伤组织中的有效成分，甘草定属于异黄酮类,光果甘草中含量约0.1%～0.3%,其提取方法多样,有热水浸提、有机溶剂提取、超高压提取和离子液体提取等。本实验以光果甘草愈伤组织为材料,采用相对安全乙醇为溶剂,在细胞水平上就光甘草定提取条件进行探索,为后期光果甘草细胞规模化培养中甘草定提取和检测提供方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

光果甘草茎段经诱导、增殖获得质量好的愈伤组织。

香草醛和光甘草标准品购自合肥博美生物科技有限公司。

1.2 仪器与试剂

主要仪器:电热恒温鼓风干燥箱,型号为DGG-9140B(上海森信试验仪器有限公司); 恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司);冷冻离心机、T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。主要试剂：乙醇、甲醇、浓硫酸等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 材料处理 选取新鲜、生长旺盛的光果甘草愈伤组织,洗净培养基,切成小块,60 ℃ 烘干,磨碎,依次过40、60目筛,得干粉。

1.3.2 单因素试验 逐个开展单因素实验,共考察4个单因素。液料比设置为50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1共5个水平,乙醇体积分数设置为50%、60%、70%、80%共4个水平,提取时间设置为20、30、60、90、120、150、180、210 min共8个水平,设置为40、50、60、70、80 ℃ 共5个温度梯度。开展某项单因素实验时,其它因素设置如下:液料比80∶1，乙醇浓度60%,60 ℃，25 min。重复3次。

1.3.3 正交设计试验 根据单因素实验结果,甘草定提取正交设计选用4因素3水平表L(3),因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平

1.3.4 含量测定 甘草定测定采用香草醛比色法,稍作调整。配制0.05 mg/mL的甘草定原液,分别吸取原液30、60、120、180、240、300 μL于比色管中,标记1～6号,加入甲醇至300 μL,加入1.5 mL 2%香草醛甲醇溶液、1.5mL 30%硫酸甲醇溶液,20 ℃反应20 min后,测定534 nm吸光值。绘制标准曲线,得A=6.615 9C-0.012 4(

R

=0.995 3),线性范围为(0.005～0.05 mg/mL)。提取量(mg/g)=C×V/m,式中:C为根据回归方程得出的物质浓度,mg/mL;V为提取液总体积,mL;m为样品干重,g。

2 结果与分析

2.1 4个单因素对甘草定提取率影响

液料比、乙醇浓度、温度和时间对甘草定提取率影响见图1,甘草定提取率均随4个因素水平梯度的增加表现出先显著升高后显著降低的趋势。液料比80∶1时,提取率最高,为0.262%,继续增大溶剂用量,提取率显著下降,但料液比为90∶1和100∶1时,提取率无显著差异。乙醇浓度为70%时提取率最高,为0.231%;提取温度升至70 ℃时,提取率最大,为0.232%,升温至80 ℃时,提取率降低了26.2%;浸提120 min时,提取率最高,为0.247%;超过120 min后,提取率显著下降。

图1 单因素试验结果

2.2 正交试验结果分析

正交试验结果见表2,方差分析及多重比较结果见表3～4。方差分析表明,4个因素对甘草定提取率的影响都达到显著水平,根据R值大小,对提取率影响的主次顺序依次为乙醇浓度>时间>液料比>温度。据多重比较分析结果并考虑成本,选定光果甘草愈伤组织中甘草定提取的最佳工艺组合A、B、C、D,即液料比80∶1、乙醇浓度70%、60 ℃、100 min。正交试验表中没有该工艺组合,因此,对优化出的工艺进行验证性试验,重复3次,提取率为0.326%,RSD为0.50%,表明该提取工艺重复性良好,适合光果甘草愈伤组织中甘草定提取。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析

表4 多重比较

3 结论与讨论

植物药用成分的最佳提取工艺因器官、组织和细胞种类而异,提取方法结果处理常用响应面法。目前甘草定提取原料皆用的是全株或根,张琳等在单因素基础上,选取对提取率影响显著的料液比、时间和温度进行中心组合试验设计,优化了光果甘草植株中甘草定的提取工艺,优化出工艺为料液比为1∶38.5(g/L)、64 min、50.4 ℃。目前还没有针对光果甘草愈伤组织中甘草定提取工艺优化研究。本研究选用乙醇为溶剂,磁力加热搅拌冷凝回流法提取,甘草定含量测定多采用高效液相色谱法,本实验选用香草醛比色法检测,与色谱法相比,比色法简便、时间短,成本低,不需要复杂高级设备,适合细胞培养条件优化和高产细胞筛选中甘草定成分检测。

综上所述,本研究进行多因素多水平正交试验,通过方差分析和多重比较分析表明,4个因素都对提取率影响达显著水平,并表现出水平差异。溶剂使用量较少时不足以溶出甘草定,但加大溶剂量可能促使其它杂质溶出,干扰了甘草定检测;甘草定属于黄酮类物质,根据相似相溶性原理,不能溶于水,易溶于乙醇,低浓度乙醇由于极性大不能很好的溶出甘草定,而高浓度乙醇极性过低也导致甘草定溶解度降低,再者可能由于高浓度乙醇增加了脂溶性杂质溶解,从而降低了甘草定提取;温度过高和长时间提取会破坏甘草定结构,导致提取率下降。最终确定光果甘草愈伤组织中甘草定的最佳提取条件为液料比80∶1、乙醇浓度70%、60 ℃、100 min。