辣椒愈伤组织的诱导及再生体系的建立

王 宁, 李二秀, 钱晶晶

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

辣椒(

Capsicum

annuum

L.)为茄科、辣椒属，园艺作物，其果实颜色紫色，有较好的推广空间。目前，我国辣椒种植面积较广，在四川、安徽等地广泛种植，仅次于白菜,居蔬菜作物第二位，产值和效益居蔬菜作物之首，其含丰富的Vc，风味独特。 多年来，辣椒病虫害十分严重，通过转基因来培育辣椒抗病毒品种受到了越来越多的关注。

目前，组织培养快繁技术在植物繁殖领域的应用越来越广泛，有关辣椒组织培养相关报道有很多，但存在着分化率低，培养周期长，不定芽生长能力弱，分化的芽不伸长等问题，满足不了基因工程育种所需的大量分化苗要求。本试验以MS培养基为基本培养基，通过添加不同激素，以及改变激素的比例，研究‘凤紫运1号’辣椒的愈伤组织诱导与再生体系，为后续遗传转化体系的建立，奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于安徽科技学院凤阳校区园艺组培室,以辣椒(‘凤紫运1号’)叶片作为试验材料。

1.2 培养条件

培养室温度为(25±2) ℃，光照强度为3 000 lx，光照时间为12 h/d，空气湿度为50%～60%。

1.3 试验方法

1.3.1 外植体获得 挑选辣椒‘凤紫运1号’幼嫩叶片，流水冲洗后，在超净工作台上，首先用无菌水冲洗3次，其次用75%消毒30 s，再次用无菌水冲洗1～2次，然后用质量分数0.1% HgCl消毒8 min，最后用无菌水冲洗4～6次。

1.3.2 不同浓度蔗糖对愈伤的诱导 以MS为基本培养基，加入6 g/L的琼脂，分别加入不同浓度的蔗糖(表1)，加入NaOH溶液调节pH为6.0±0.2，然后放入高压灭菌锅中121 ℃，灭菌20 min。在超净工作台中，以辣椒叶片为外植体，切成的方形叶片，在叶脉处划伤口，接入含有不同浓度蔗糖的培养基中(表1)。共6组处理，每组12个重复。35 d后观察出愈数、愈伤的颜色大小及状态，计算出愈率。

表1 不同浓度蔗糖诱导愈伤处理组编号

1.3.3 不同激素配比对愈伤组织的诱导 以MS为基本培养基，分别加入6 g/L的琼脂和25 g/L的蔗糖，加入不同浓度的6-BA和IBA(表2)，加入NaOH调节pH为6.0±0.2，放入高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。在超净工作台中，以辣椒叶片为外植体，切成的方形叶片在叶脉处划伤口，接入含有不同浓度6-BA和IBA的培养基中(表2)。共10组处理，每组12个重复。35 d后观察出愈数、愈伤的颜色大小及状态，计算出愈率。

表2 不同浓度激素诱导愈伤配比情况

1.3.4 不同激素配比对愈伤组织不定芽的分化 以MS为基本培养基，加入6 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖，加入不同浓度的6-BA和NAA(表3)，加入NaOH调节pH为5.8±0.2，放入高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。在超净工作台中，以1.3.2节中生长健壮淡绿色致密颗粒状的愈伤组织为外植体，切成小块，接入含有不同浓度6-BA和NAA的培养基中(表3)。共17组处理，每组12个重复。每周进行1次观察，42 d后统计愈伤组织分化的出苗数，并计算愈伤分化率。

表3 不同浓度激素诱导不定芽分化配比情况

1.3.5 不同浓度激素对不定芽的增殖 以MS为基本培养基，加入6 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖，加入不同浓度的IAA(表4)，加入NaOH调节pH为5.8±0.2，放入高压灭菌锅中121 ℃，灭菌20 min。在超净工作台中，将诱导出的不定芽接入含有不同浓度IAA的培养基中(表4)。共6组处理，每组做12个重复。每周进行1次观察，30 d后统计不定芽增殖株数和增殖不定芽总数，并计算不定增殖率和平均增殖数。

表4 不同浓度激素诱导不定芽增殖的配比情况

1.3.6 不同浓度激素对不定芽的生根 以MS为基本培养基，加入6 g/L的琼脂和30 g/L的蔗糖，加入不同浓度的NAA(表5)，加入NaOH调节pH为6.0±0.2，放入高压灭菌锅中121 ℃，灭菌20 min。在超净工作台中，将诱导出的不定芽接入含有不同浓度NAA的培养基中(表5)。共6组处理，每组12个重复。每周进行1次观察，30 d后统计生根株数和生根总数，并计算不定芽生根率和平均生根数。

表5 不同浓度激素诱导不定芽生根的配比情况

2 结果与分析

2.1 不同浓度蔗糖对愈伤诱导的影响

由表6可以看出，不同浓度蔗糖对辣椒愈伤组织诱导有不同的影响。愈伤诱导率由大到小依次为T4、T5、T6、T2、T1、T3， T4与T5差异不显著，T4、T5与其他处理组差异显著。处理组T1、T2、T3、T4诱导的愈伤组织状态是白色糊状，处理组T5诱导的愈伤组织状态是白色颗粒状，处理组T6诱导的愈伤组织状态是淡黄色颗粒状，白色颗粒状的愈伤组织适宜愈伤再分化。综上所述，处理组T5能够诱导出适宜分化的愈伤组织，且愈伤诱导率相对较高为86.11%。

表6 不同浓度蔗糖对辣椒愈伤组织诱导的影响

2.2 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

由表7可以看出，不同激素配比对辣椒叶片愈伤组织诱导有不同的影响。诱导率处理组A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A10差异不显著，与A9差异显著。A1、A2、A3、A4、A5诱导的愈伤组织为白色紧实，不适宜再分化；A6和A7诱导的愈伤组织为淡绿色紧实，不适宜再分化；A8和A9诱导的愈伤组织为淡绿色致密颗粒状，适宜再分化；A10诱导的愈伤组织为褐色致密颗粒状，不适宜再分化。综上所述，处理组A8诱导的愈伤组织适宜再分化，且愈伤诱导率达到了83.13%。

表7 不同浓度激素对辣椒愈伤组织诱导的影响

2.3 不同浓度激素对愈伤组织不定芽分化的影响

将愈伤组织接种到不同浓度激素配比的培养基中进行分化培养，培养42 d后，由图1可以看出，处理组B3愈伤分化率最高为58.33%，B3与B4、B7差异不显著。由图2～3可以看出，培养21 d后，处理组B3绿色愈伤组织分化出不定芽，处理组B4愈伤组织只分化出叶片，部分愈伤组织颜色为绿色，处理组B7愈伤组织为深紫色，还未分化。综上所述，处理组B5愈伤分化率最高，且诱导的不定芽长势良好。

图1 不同浓度激素对辣椒愈伤再分化的影响

图2 培养21 d不同浓度激素愈伤组织再分化状况

2.4 不同浓度激素对辣椒不定芽增殖的影响

把辣椒分化出来的不定芽接种到含有不同浓度IAA的培养基中，经过30 d的培养，不同浓度的IAA对辣椒不定芽增殖率与增殖数有不同的影响。由图3可以看出，增殖率由大到小次为C4、C5、C3、C6(C2)、C1，C4的增殖率最高为56.32%，且与其他处理差异显著。由图4可以看出，平均增殖数最高的为C4，平均增殖数为2.5个，与其他处理差异显著，且不定芽生长健壮(图5e)。综上所述，0.3 mg/L IAA对辣椒不定芽的增殖效果最好。

图3 不同浓度激素对辣椒不定芽增殖率的影响

图4 不同浓度激素对辣椒不定芽增殖数的影响

图5 辣椒愈伤诱导至不定芽增殖过程图

2.5 不同浓度激素对辣椒不定芽生根的影响

不同浓度NAA对辣椒不定芽生根影响不同，培养30 d后，由图6可以看出，不同浓度NAA对诱导不定芽生根率由高至低依次为D2、D3、D1、D4、D5，由图7可以看出，不同浓度NAA对诱导不定芽平均根长由高至低依次为D2、D5、D1、D4、D3，D2处理的生根率和根长都处于最高，D2生根率为93.73%，平均根长为2.745 cm，D2与其他处理差异显著。综上所述，0.05 mg/L NAA对辣椒生根效果最好。

图6 不同浓度激素对辣椒生根率的影响

图7 不同浓度激素对辣椒平均根长生长的影响

3 结论与讨论

辣椒组织培养的外植体主要以叶片、下胚轴、花药等为主，经试验研究出，辣椒叶片对激素的反应较为敏感，愈伤诱导率较高，愈伤组织表面光滑有光泽，一般颜色多为白色或淡绿色，致密颗粒状，易于生根发芽。如果植物想要从分化状态过渡到有繁殖能力的分化状态，必须经历细胞的改变，否则将无法进行过渡。愈伤组织通过细胞全能性，添加不同配比的激素能够诱导出完整的植株。

研究表明，基本培养基对不同基因型的辣椒组织培养影响差异不明显, 而不同种类的激素及配比对不同基因型辣椒组织培养有较大影响。辣椒‘凤紫运1号’愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+(25 g/L蔗糖)+(0.3 mg/L 6-BA)+(0.4 mg/L IBA)组合；愈伤组织分化的最佳培养基为MS+(30 g/L蔗糖)+(0.1 mg/L 6-BA)+(0.1 mg/L NAA)，与李伟等研究结果一致，在辣椒愈伤组织分化的过程中6-BA是重要的激素之一，同时配以IAA、NAA、ZT等激素效果更好；不定芽增殖的最佳培养基为MS+(30 g/L蔗糖)+(0.3 mg/L IAA)组合，与尤嘉禾等研究结果相同，吲哚-3-乙酸(IAA)常用于诱导不定芽增殖；适宜生根培养基为MS+(30 g/L蔗糖)+(0.05 mg/L NAA)组合，与王金祥等研究结果相同，NAA用于诱导不定根的激素配方。本研究建立了辣椒‘凤紫运1号’愈伤组织诱导与高效的再生体系，为后续的遗传转化体系的建立奠定了基础。