与南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10互作的寄主因子筛选

张瑞芳 张合红 魏中艳 陈剑平 孙宗涛

(1 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002； 2宁波大学植物病毒学研究所，浙江 宁波 315211)

水稻(Oryza sativaL.)在我国具有悠久的种植历史，是重要的粮食作物之一。近年来由于环境及气候的变化，水稻病毒病大面积爆发，严重威胁水稻产量[1]。南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streak dwarf virus，SRBSDV) 是由介体白背飞虱(Sogatella furcifera，WBPH)进行传播的双链RNA 病毒[2-3]，于2001年在广东省首次发现。水稻各个发育时期均可被该病毒侵染，发病症状为植株矮化、叶片颜色深绿、节部有气生须根及高节位分枝、茎秆表面有乳白色瘤状突起、根系不发达且须根少而短、一般不抽穗或抽包颈穗、结实率低[4-5]。

根据SRBSDV 基因组序列特性，将其归为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第二小组。其病毒粒子呈正二十面体球状对称结构，直径约75 ～80 nm，具有多层结构，病毒核心粒子(直径50 ～55 nm)光滑无刺突，病毒粒子的内衣壳有塔状B-刺突，外衣壳具有B-刺突和A-刺突。SRBSDV 病毒粒子对有机溶剂非常敏感，因此实验室使用氯仿处理纯化后可得到表面光滑的病毒粒子[6-7]。SRBSDV 在基因组序列水平上与水稻黑条矮缩病毒(rice black-streakeddwarf virus，RBSDV)最为相似，均由十条双链RNA 组成，根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，由慢到快，依次命名为S1 ～S10；该病毒的全基因组由29 106～29 115 bp 个核苷酸组成，其中S5、S7 和S9 均有2 个开放阅读框，共编码13 个蛋白，S10 大小为1 797 bp，编码P10 蛋白，大小为65.9 kDa，是病毒粒子的外壳蛋白[8]。在植物病毒中外壳蛋白是研究最早、最广泛的病毒蛋白之一[9]。前期研究发现，RBSDV P10 具有自互作[10-11]，通过免疫荧光蛋白技术观察到RBSDV P10 定位在细胞核及质膜上[12]。在水稻中表达RBSDV P10 可介导植物的抗病毒能力[13]，但关于P10 在SRBSDV 侵染过程的作用机制，以及对寄主因子的选择，国内外鲜见相关研究报道。基于此，本研究对SRBSDV P10 蛋白功能展开研究，通过对寄主因子功能的研究揭示P10 蛋白及其互作寄主因子在病毒侵染循环中的作用。酵母双杂交是一种用来筛选蛋白互作因子的常见技术手段，在分子生物学研究领域应用十分广泛。该技术不仅可以检测已知功能蛋白间的互作，还可以设计已知功能的蛋白质作为诱饵蛋白，从酵母文库中钓取与其互作的未知蛋白[14]，或者用未知功能的蛋白质作为诱饵蛋白进行酵母文库筛选，通过研究已知功能的猎物蛋白推测诱饵蛋白的功能[15]。因此本研究通过DUAL膜系统(DUAL membrane system) 酵母双杂系统来筛选水稻中与SRBSDV P10 互作的寄生蛋白。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻品种为日本晴，种植于山东省农业科学院实验田中，水稻幼苗自然感病SRBSDV 后，取样送上海欧易生物技术公司提取RNA，并构建酵母双杂交膜体系cDNA 文库；文库与酵母表达载体pBT3-SUC、pBT3-STE 以及pBT3-N 均来自上海海科生物科技有限公司；大肠杆菌感受态(DH5α)购自杭州雅邦生物科技有限公司；酵母感受态(NMY51)购自上海唯地生物技术有限公司。Trizol 购自生工生物工程(上海)股份有限公司；cDNA 合成试剂盒购自南京诺唯赞生物技术有限公司；KOD FX 高保真扩增酶购自日本TOYOBO公司；Thermo Scientific FastDigest Sfi1 购自加拿大Fermentas 公司；PEG-LiAc 购自南京百思禾生物科技有限公司；酵母质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；大肠杆菌质粒提取试剂盒购自美国Promega 公司。

1.2 诱饵表达载体的构建

根据SRBSDV P10 的编码序列(coding sequence，CDS)设计引物进行PCR 扩增，表1 为RT-PCR 基因扩增特异性序列。PCR 体系为50 μL:25 μL 2×PCR Buffer、5 μL 2 mmol·L-1dNTPs、引物-F 和引物-R 各1.5 μL、cDNA 模板和KOD FX 高保真扩增酶各1 μL、15 μL 无菌水补全体积。将上述试剂混匀后按以下程序进行PCR 扩增:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35 个循环；72℃终延伸10 min，然后进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。

表1 RT-PCR 基因扩增特异性序列Table 1 RT-PCR gene amplification specific sequences

诱饵载体酶切位点为Sfi1，单酶切体系为50 μL:pBT3-SUC、pBT3-STE 或pBT3-N 质粒40 μL；10×Fast Green Buffer 5 μL；Sfi1 内切酶5 μL。混合均匀后于37℃水浴锅放置30 min 后进行琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，回收产物即为pBT3-SUC、pBT3-STE 与pBT3-N 载体。将回收的PCR 产物与载体按10 μL 体系连接。于0.2 mL PCR 管中依次加入4.5 μL PCR 产物、2.5 μL 载体片段、2 μL 5×CEⅡBuffer、1 μL 重组酶，混合均匀后放入PCR 仪(德国Eppendof 公司)，连接程序为37℃，30 min。将连接产物加到50 μL DH5α 感受态中，冰上放置30 min 后放入42℃水浴锅中热激90 s，加入无抗LB 液体培养基于37℃摇床培养1 h，5 000 r·min-1离心收菌涂布于LB(luria-bertani)固体培养基(加入Kan 抗生素)，37℃培养箱培养12 h 后挑取单克隆进行测序，由杭州擎科梓熙生物有限公司完成。将测序结果正确的菌落进行扩大培养，提取质粒用于后续文库筛选。

1.3 酵母自激活检测和功能检测

取实验室已购酵母NMY51 菌株，划线于YPDA(yeast extract peptone dextrose adenine medium)固体培养基，30℃培养2～3 d，挑取生长旺盛的白色单克隆于4 mL 液体培养基，30℃、225 r·min-1振荡培养18～20 h(过夜)，至OD600＝4。转接YPDA 液体培养基，体积为50 mL，使初始OD600＝0.2，30℃、225 r·min-1振荡培养4～5 h，至OD600＝0.6，室温下4 000 r·min-1离心5 min收菌，弃上清。用20 mL 无菌水重悬菌体后混匀，室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。用5 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重悬菌体混匀，室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。用500 μL 0.1 mol·L-1LiAc 重悬菌体后混匀，分装至1.5 mL 离心管，每个50 μL，依次加入400 μL PEG-LiAc、10 μL 鲑鱼精DNA、以下质粒各5 μL，共10 μL 组合:pNubG-Fe65 ＋PTSU2-APP(阳性对照)、pPR3N ＋PTSU2-APP(阴性对照)、PR3N ＋pBT3-STE-P10(自激活检测1)、pPR3N ＋pBT3-SUCP10(自激活检测2)、pPR3N＋pBT3-N-P10(自激活检测3)、pOST1-Nub1 ＋pBT3-STE-P10(功能检测1)、pOST1-Nub1 ＋pBT3-SUC-P10(功能检测2)、pOST1-Nub1＋pBT3-N-P10(功能检测3)用枪头吹打混匀。将混合液于30℃水浴孵育30 min，之后42℃水浴热激25 min，再30℃水浴复苏30 min。室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。每个转化用100 μL 无菌水重悬菌体，分别涂布SD-Trp/Leu、SD-Trp/Leu/His、SDAde/His/Leu/Trp 以及SD-Leu 缺陷型筛选平板。30℃恒温培养3～4 d，记录每块平板上的克隆数，并计算每个转化反应在缺陷平板上的转化子数量和生长率。

1.4 文库筛选

选择pBT3-SUC-P10 作为筛库诱饵质粒，从转化的SD-Leu 平板上挑取单克隆菌落接种于5 mL SD-Leu液体培养基中，30℃、225 r·min-1振荡培养18 h 后转接于200 mL YPDA 液体培养基中，30℃、225 r·min-1振荡培养4～5 h，至OD600＝0.6。室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。用30 mL 无菌水重悬菌体，混匀后室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。用20 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重悬菌体，混匀后室温4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。用10 mL 0.1 mol·L-1LiAc 重悬菌体，混匀后室温4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清。向离心管中依次加入以下试剂:200 μL 鲑鱼精DNA、5 mL PEG-LiAc、25 μL cDNA 文库质粒，吹打混匀。30℃水浴孵育30 min，42℃水浴热激25 min，30℃水浴复苏1 h。室温下4 000 r·min-1离心5 min 收菌，弃上清，用4 mL 无菌水重悬菌体，温和混匀后涂SD-Trp/Leu/His ＋20 mmol·L-13-氨基-1，2，4 -三唑(3，amino-1，2，4-triazde，3AT)，抑制酵母自激活)平板，每100 μL，共40 块。置于30℃恒温培养3～4 d，挑取酵母单克隆转至SD-Ade/His/Leu/Trp 平板，30℃培养2 ～3 d。将SD-Ade/His/Leu/Trp 平板上生长旺盛的酵母菌落转接至SD-Ade/His/Leu/Trp 液体培养基，30℃、225 r·min-1振荡培养18 h，准备提取酵母质粒。

1.5 酵母质粒的提取及回转验证

培养的酵母菌液于12 000 r·min-1离心1 min 后收菌并加入300 μL 的山梨醇缓冲液和50 U 的Lyticase溶壁酶，30℃振荡培养1 h；室温条件下12 000 r·min-1离心2 min，弃上清，加入250 μL 的YP1 溶液(加入RNaseA)，旋涡振荡15 s 后转移至新的1.5 mL 离心管中；向管中加入250 μL 的YP2 溶液，温和的上下翻转3～5 次，室温放置6 min，以便充分裂解，此时溶液变得澄清透明，开盖会有拉丝现象；加入350 μL 的YP3 溶液，立刻温和的上下翻转6 ～8 次，管内产生白色絮状沉淀；12 000 r·min-1离心10 min；将上清液转移到吸附柱中，12 000 r·min-1离心1 min，重复过柱可提高吸附效率；加入500 μL 的去蛋白PD 溶液洗去多余的蛋白质，12 000 r·min-1离心1 min；加入650 μL 的PW 漂洗液，12 000 r·min-1离心1 min，重复1 次；将吸附柱空离心2 min 后开盖2 min，以便充分挥发残余的酒精；向吸附柱内加入适量的灭菌水，室温放置5 min 后12 000 r·min-1离心2 min，将酵母质粒充分洗脱在新的1.5 mL 离心管中。将提取的酵母质粒送杭州擎科梓熙生物有限公司测序，测序成功的质粒与诱饵质粒pBT3-SUC-P10 分别进行回转。

2 结果与分析

2.1 诱饵载体构建

本研究以南方黑条矮缩病毒侵染后的水稻为材料，提取总RNA 后反转为cDNA 作为模板，根据SRBSDV P10 序列设计上下游引物进行PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果与预期一致，约在1 700 bp 处出现特异性条带，电泳结果如图1 所示。将克隆得到的SRBSDV P10 cDNA 片段连接到pBT3-SUC、pBT3-STE以及pBT3-N 载体中，构建pBT3-SUC-P10、pBT3-STEP10 以及pBT3-N-P10。测序结果表明，以上3 个载体的目的序列正确，成功获得了诱饵表达载体。

图1 RT-PCR 克隆P10 全长Fig.1 RT-PCR clone P10 full length

2.2 功能验证

在检测膜蛋白酵母双杂交系统的功能时，如果诱饵蛋白在酵母细胞内具有表达功能，便会依据诱饵蛋白在缺少3 种氨基酸的SD-Trp/Leu/His 和缺少4 种氨基酸的SD-Ade/His/Leu/Trp 筛选平板上有10%～100%的生长率，而自激活检测的SD-Trp/Leu/His 和SD-Ade/His/Leu/Trp 筛选平板上，应观察不到显著的生长。在表2 阳性对照反应中，pTSU2-APP 与pNubGFe65 具有较强的相互作用，而作为阴性对照的pTSU2-APP 与pPR3N 在SD-Trp/Leu/His 和SD-Ade/His/Leu/Trp 筛选平板上的生长明显少于阳性对照。检测诱饵基因功能时发现载体pBT3-N-P10 在SD-THL 筛选平板上生长较好，但在SD-Ade/His/Leu/Trp 筛选平板上生长较少；而pBT3-SUC-P10、pBT3-STE-P10 在SD-Ade/His/Leu/Trp 筛选平板上生长均较好，但在自激活检测时发现pBT3-STE-P10 存在自激活，不适合用于筛库。pBT3-SUC-P10 有功能，虽然存在轻微的自激活，但能被5 mmol·L-1的3AT 所抑制，因此选择其作为后续双杂交筛选试验的诱饵克隆。

表2 各组酵母在不同培养基上生长克隆数统计分析Table 2 Statistical analysis of the number of colonies grown by different groups of yeast on different media

2.3 筛库结果

酵母双杂交膜体系是由酶切连接的方法实现建库，主要是基于分离的泛素介导膜蛋白互作信号的识别。将含有pBT3-SUC-P10 诱饵质粒的NMY51 酵母转化子作为受体菌制备感受态，将水稻文库质粒pPR3N-WYQ-Mus-LIV 转入其中，涂SD-Trp/Leu ＋5 mmol·L-13AT 缺陷平板上，培养到第3 天时，挑取生长正常的单克隆划线于SD-Ade/His/Leu/Trp 缺陷平板上(图2)，培养3 d 后将阳性克隆酵母菌株分别提取质粒测序。

图2 诱饵质粒在不同培养基中的生长情况Fig.2 Growth of bait plasmids in different media

测序结果在 NCBI ( National Center for Biotechnology Information)网站上进行BLAST 比对。将目的基因序列进行比对分析后，挑选10 个具有全长基因序列的克隆进行统计，结果如表3 所示，得到基因与已有报道比对分析，包括硫氧还蛋白H1、胚胎晚期富含Lea14-A 蛋白、G 蛋白偶联受体107 以及之前有报道的真核翻译起始因子5A 等与生长发育及植物抗逆相关的蛋白。

2.4 回转验证

根据上述整理的筛库结果，选出感兴趣的候选因子，将这些基因进行酵母双杂交回转验证。首先将筛选出的含有这些基因片段的酵母质粒转化到DH5α 大肠杆菌感受态中，涂氨苄(ampicillin)抗性的LB 平板，分离出猎物蛋白后与 pBT3-SUC-P10 共同回转NMY51，试验设置pBT3-SUC-P10 和pPR3N 为阴性对照，共转产物涂布于SD-Trp/Leu 缺陷平板上，30℃培养箱生长3 d 后将酵母菌落转接至SD-Ade/His/Leu/Trp 缺陷平板上，酵母双杂交结果如图3 所示。P10 蛋白与目的基因片段共转后的产物均能在缺陷培养基上正常生长，阴性对照没有生长，说明P10 与分离出的猎物蛋白经回转验证后能够在酵母细胞中发生互作。

3 讨论

图3 酵母回转验证P10 与酵母分离猎物蛋白的互作Fig.3 Yeast rotation verification of the interaction between P10 and yeast isolated prey protein

表3 酵母双杂交筛选阳性克隆的生物学信息统计表Table 3 Biological information statistics of yeast two-hybrid screening of positive clones

本研究前期发现RBSDV P10 转基因水稻可以增强对RBSDV 及同属SRBSDV 的抗性，但是在其他病毒如纤细病毒属的水稻条纹病毒(rice stripe virus，RSV)侵染水稻时会抑制植物防御反应[13]，而SRBSDV P10 作为外壳蛋白在病毒侵染寄主植物时的发挥作用机制尚不明确。已有研究发现RBSDV P10 定位在细胞质膜与细胞核上[12]，而SRBSDV 在功能与结构上与其具有高度同源性，因此本研究选择DUAL 膜系统酵母双杂系统筛选与P10 互作的蛋白。DUAL 膜系统酵母体系是一种基于酵母的筛选测定方法，用于鉴定和表征天然状态下完整膜蛋白、膜相关蛋白和可溶性蛋白之间的相互作用，以及在细胞膜上原位检测全长整合膜蛋白之间的相互作用[16]。

DUAL 膜系统筛库载体pBT3-SUC、pBT3-STE 以及pBT3-N 具有不同的作用结构域，因此先进行功能验证以确定筛库诱饵载体。分别构建pBT3-SUC-P10、pBT3-STE-P10 以及pBT3-N-P10 载体，为了验证筛库诱饵的自激活与功能检测，将构建好的3 个诱饵质粒分别与pPR3N 及pOST1-Nub1 进行一对一酵母双杂试验。结果表明，pBT3-STE-P10 存在自激活，相较于pBT3-N-P10，pBT3-SUC-P10 更具有活性，是最适合进行筛库的诱饵质粒。

利用pBT3-SUC-P10 质粒与水稻cDNA 文库质粒进行筛库，将其转入NMY21 菌株后涂板，在SD-AHLT上生长出来的阳性克隆提取质粒测序，筛选到10 个不同的猎物蛋白，将这些蛋白与pBT3-SUC-P10 进行一对一酵母双杂回转试验，结果发现均具有互作作用。这些蛋白包括与植物早期发育相关的胚胎发育晚期丰富蛋白Lea14-A、硫氧还原蛋白TRX-H1、铁硫结合蛋白IscA 以及真核生物起始翻译因子eIF-5A 等。胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA 蛋白)主要在植物种子发育晚期大量积累，且在植物处于逆境时被诱导产生的一种应激蛋白，与抗多种胁迫相关[17]。水稻中过表达OsLea14-A可以提高对脱水、高盐及重金属的耐受性[18]。铁硫簇是生物学中最常见的氧化还原中心类型之一。已有研究报道，IscA 能够募集细胞内铁并为蛋白质中的铁硫簇输送铁[19]。硫氧还原蛋白(thioredoxin H1-like，Trxs)是植物中蛋白质的多基因家族，通过硫醇-二硫键交换反应在氧化还原平衡调节中起关键作用[20]。水稻中OsTRXh1 调节质外体的氧化还原状态，并影响植物发育和胁迫响应[21]。研究发现，eIF-5A 并非传统意义上的真核翻译起始因子，可能只在某些特殊代谢途径中合成蛋白时所需[22]。有研究表明在水稻中，OseIF5A与RBSDV P10 发生互作，并且可能受植物发育和环境胁迫的调节[23-24]。早期的光诱导蛋白(early light-induced protein，ELIP)属于光捕获复合物的多基因家族，它们结合叶绿素并吸收绿色植物中的太阳能[25-26]。在茶树[Camellia sinensis(L) O. Ktze.]中，CsELIP基因在茶叶中发生光抑制时显著上调，表明它们可能参与光保护作用[27]，以及在棉花中(Gossypiumspp)发现GhELIP1 基因在衰老叶片中的表达量最高，表明GhELIP1 基因参与棉花叶片的衰老调控[28]。这些基因的发现说明水稻受到病毒侵染时，生长发育与营养物质的合成均受到影响，可为进一步研究SRBSDV 致病机理提供参考。

4 结论

本研究以南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10作为诱饵载体，通过筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库，找到水稻中与P10 互作的蛋白，结合生物信息学技术进行分析，回转验证，筛选到10 个可能与P10互作的水稻寄主蛋白，为后续进一步研究P10 蛋白的功能提供了理论依据。