刘 亮 王 丹 王 诚 陈 红 胡国宇 黎 青
(1西南科技大学生命科学与工程学院,四川 绵阳 621010;2 四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川 成都 610011)
栀子(Gardenia jasminoidesEllis),又名黄栀子、山栀,茜草科(Rubiaceae)栀子属(Gardenia)常绿灌木,枝叶繁茂,叶色常青,花朵洁白芳香,是城市中广泛运用的园林观赏植物之一,主要分布于全球热带和亚热带地区,尤其在我国长江以南[1]。目前对于栀子的研究主要集中在药理作用[2-5]、栽培生长[6-8]、工艺价值[9-10]等方面,而关于观赏性品种的培育较少。
选用适宜的辐射剂量是提高诱变效率的关键。一般认为辐射种子或枝条的最佳剂量应该选择在临界剂量附近[11]。但高剂量辐射会破坏生长启动子并诱发生长抑制剂以及各种染色体畸变,导致植株存活率降低,后期育种可供选择的植物量较少,限制了突变体的选择与鉴定[12]。因此,需要筛选适宜的辐射保护剂,对辐射诱变过程的植株进行保护,以期提高变异植株成活率,获得更多优良变异。有研究发现氯化钠(NaCl)[13]、半胱氨酸(cysteine,Cys)[14-15]、维生素C(vitamin C,Vc)[16]具有一定的辐射保护作用。但植物辐射诱变育种中运用保护剂的研究相较于动物仍然较少。本研究运用3 种保护剂浸泡60Co-γ 射线辐射后的栀子插条,分析栀子插条的辐射损伤效应及3 种保护剂的保护效应,以期为栀子的辐射诱变育种及保护剂应用提供参考。
2019年5月13日于西南科技大学选取桅子观赏型品种白蟾(G. jasminoidesvar.fortuniana)长势优良的树上半木质化、无病虫害的1年生枝条,剪成10 ~15 cm,2~3 片余叶的插条。每辐射剂量840 根插条,共4 200 根,每20 根一捆,绑好用湿毛巾保湿。
NaCl、Vc 购自成都市科隆化学品有限公司;Cys 购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,均为分析纯。
60Co-γ 射线辐射源由四川省农业科学院生物技术核技术研究所提供。辐射剂量分别为0(CK)、5、10、20、40 Gy,剂量率为1.42 Gy·min-1。将完成辐射后的插条按照每个辐射剂量下设置不作任何浸泡处理(CK1)和泡水处理(CK2)两个对照组,再分别设置3 种保护剂处理:NaCl(2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1),Cys(0.12、0.18、0.24、0.30 g·L-1),Vc(0.05、0.06、0.07、0.08 g·L-1),分组进行保护剂浸泡,遮光密封浸泡36 h。每组60 根插条,3 个重复。
使用吲丁诱抗素(江西新瑞丰生化股份有限公司生产)浸泡辐射处理后的插条下端3 cm 处30 s。然后按裂区试验设计区组扦插。场地为西南科技大学温室大棚,以50 孔穴盆,规格54 cm×28 cm×9 cm 为扦插容器,扦插基质为蛭石∶珍珠岩=1 ∶1。浇透水后进行扦插。使用75%遮阴网,控制棚内温湿度为栀子插条适宜温湿度。2019年5月15日扦插,7月2日统计插条生根情况及存活率后进行移栽。将每10 株生根插条移栽至40 cm×15 cm×18 cm 种植盆,栽培基质为有机基质∶蛭石∶珍珠岩=1 ∶1 ∶1酸性土壤,并进行生长期管理。12月20日观察统计植株分枝数、叶片数、节间长度、叶长叶宽等生长形态指标。
插条大量生根后,挖出统计生根插条数、存活插条数及根长、根数,计算生根率和存活率。存活插条数为截止移栽时生根插条数及未生根但未失绿死亡插条数的总和。将生根插条进行移栽,每两周观察统计移栽后插条的成活情况。11月20日统计最终成活植株数,计算成株率。成活后一个月进行植株节间长度、分枝数、叶片数、叶长叶宽等形态指标统计。植株生长过程中,观察统计各处理组相比对照组叶片形态有所区别的植株数,计算叶片形态变异率。
采用SPSS 25.0 对数据进行统计分析,采用Origin 9.0、Office 2003 软件作图。数据均为3 次及以上重复的平均值±标准差。
2.1.1 辐射处理对栀子插条生根率、存活率及成株率的影响 由表1 可知,经4 种不同辐射剂量的60Co-γ射线辐射后,栀子插条的生根率、存活率及成株率变化明显。其中生根率及成株率除5 Gy 剂量组略高外,其余均低于CK,随着辐射剂量的增加逐渐降低;20 Gy辐射剂量下,生根率为CK 的43.66%,显著低于0 ~10 Gy;40 Gy 辐射剂量下生根率最低,仅为CK 的1.97%。20 Gy 辐射剂量下,成株率下降为CK 的37.94%;40 Gy 辐射剂量下,成株率下降为仅CK 的1.97%。经不同剂量辐射后的栀子插条存活率总体呈下降趋势;20和40 Gy 辐射剂量下栀子插条的存活率显著低于CK,分别比CK 下降了14.17 和22.75 个百分点。
通过对辐射后插条的相对生根率(y1)、相对存活率(y2)及相对成株率(y3)与辐射剂量(x)的相关性进行回归分析,得到标准曲线方程分别为y1=-2.709 4x+107.49,y2=-0.619 1x+100.55,y3=-2.682 7x+104.46,相关系数分别为-0.957 8、-0.962 7、-0.953 1。计算得栀子插条的半生根剂量(half-rooting dose,RD50)为21.22 Gy,半致死剂量(half-lethal dose,LD50)为81.65 Gy,半成株剂量(half-planting dose,PD50)为20.30 Gy。
2.1.2 辐射处理对栀子插条形态指标的影响 由表2 可知,随着辐射剂量的增加,插条各形态指标总体呈下降趋势。5 Gy 辐射剂量下单根插条生根数、叶片数、叶长、叶宽,以及10 Gy 辐射剂量下节间长度、叶长、叶宽均高于CK,但不显著,说明5 ~10 Gy 辐射剂量对插条生长有一定的促进作用。除了分枝数和叶宽,栀子单根插条的生根数及根长、节间长度、叶片数和叶长均呈现相同的变化规律,即5 ~10 Gy 辐射剂量处理组与CK 无显著差异,20 Gy 及以上辐射剂量组插条各形态指标均明显低于0 ~10 Gy 辐射处理组。而经辐射处理后插条分枝数均明显低于CK,其中40 Gy辐射剂量下分枝数显著低于5~20 Gy 辐射处理组,5~20 Gy 辐射处理间无显著差异。栀子叶片宽度在5 ~20 Gy 辐照剂量下与CK 无显著差异,20 Gy 辐射下叶宽较5~10 Gy 显著降低,40 Gy 辐射处理下,显著低于其他处理组。由此可知,辐射剂量增大,对栀子插条的生根和生长抑制作用增大,对插条损伤效应增大。
表1 不同辐射剂量对栀子插条生根率、存活率、成株率的影响Table 1 Effects of 60Co-γ ray with different doses on rooting rate,survival rate and planting rate of gardenia cuttings /%
表2 不同辐射剂量对栀子插条形态指标的影响Table 2 Effects of 60Co-γ ray with different doses on morphological indexes of gardenia cuttings
2.2.1 保护剂对辐射后栀子插条生根率及存活率的影响 采用不同浓度NaCl、Cys、Vc 浸泡辐射后的栀子插条,并统计其生根率和存活率(表3),0 ~10 Gy 辐射剂量处理下,3 种保护剂对栀子插条生根率影响不明显。20 Gy 辐射剂量下,3.00 g·L-1NaCl 处理的桅子插条生根率比CK2明显提高了23.90 个百分点。而经0.12 g·L-1Cys 处理的栀子插条生根率比CK2显著降低了36.82 个百分点,说明20 Gy 辐射剂量下,0.12 g·L-1Cys 处理增加了对栀子插条的损伤。不同浓度Vc 处理间插条生根率与CK2无显著差异。40 Gy 辐射剂量下,0.12 g·L-1Cys 和0.08 g·L-1Vc 处理显著提高了插条生根率,相比CK2分别提高了16.99 和15.76 个百分点。由此可知,保护剂对高剂量辐射下的栀子插条生根情况具有一定的保护作用,而对低剂量辐射的插条保护作用不明显。
对经保护剂处理后的栀子插条存活率进行分析发现,3 种保护剂不同浓度处理对栀子插条存活率保护作用不显著。而Cys 不同浓度处理对除10 Gy 辐射剂量外的其他辐射剂量处理组栀子插条存活率有一定降低作用,死亡插条主要表现为表皮腐烂。0 Gy 辐射剂量下,0. 30 g·L-1Cys 处理显著降低了插条存活率。5 Gy 辐射剂量下,0. 18 ~0. 30 g·L-1Cys 处理显著降低了插条存活率。20 Gy 辐射剂量下,0. 12 g·L-1Cys 处理后的插条存活率显著降低。40 Gy 辐射剂量下,0. 18 和0. 30 g·L-1Cys 处理组存活率显著降低,表明Cys 具有一定的毒副作用[17],在不同的辐射剂量下,不同浓度Cys可能产生毒副作用也可能产生保护作用。
2.2.2 保护剂对辐射后栀子插条根长根数的影响 由图1 可知,3.00 g·L-1NaCl 处理对5 Gy 剂量辐射后栀子插条的根长具有显著的抑制作用,但对20 Gy 剂量辐射处理具有显著的促进作用。20 Gy 剂量辐射处理下,3.00 和4.00 g·L-1NaCl 处理组根长分别是对照的1.87 和1.66 倍。不同浓度Cys 对各辐射剂量下栀子插条根长影响不显著。0.05~0.07 g·L-1Vc 处理对0 Gy 辐射剂量下栀子插条根长具有明显提高;且40 Gy 辐射剂量时,0.06 和0.08 g·L-1Vc 处理较对照显著提高了根长,分别为对照的3.78 和4.74 倍。
表3 保护剂对辐射后栀子插条生根率及存活率的影响Table 3 Effects of protective agents on rooting rate and survival rate of gardenia cuttings after radiation treatment /%
由图2 可知,NaCl 对高剂量辐射下的插条生根数有明显的促进作用。20 Gy 剂量辐射时,3.00 g·L-1NaCl 处理组单根插条生根数为对照的1.63倍。40 Gy 剂量辐射时,4.00 和5.00 g·L-1NaCl 处理生根数明显增加,分别是对照的2.68 和3.68 倍。0.12 和0.18 g·L-1Cys 处理对40 Gy 辐射处理组生根数具有明显提高作用,插条生根数分别是对照的3.74 和2.52 倍。但0.30 g·L-1处理对5 Gy 辐射处理组生根数具有显著抑制作用。说明Cys 对低剂量辐射处理组插条加剧了伤害作用,对高剂量辐射处理插条具有保护作用。0.07 和0.08 g·L-1Vc 处理显著提高了40 Gy 辐射剂量组生根数,分别是对照的3.28 和4.79 倍。
由此可知,3 种保护剂对低剂量辐射的栀子插条生根保护效应不显著。而高剂量辐射时,3 种保护剂不同浓度处理对插条生根数及根长具有较好的促进作用。
图1 保护剂处理对辐射后栀子插条根长的影响Fig.1 Effects of protective agents on root length of gardenia cuttings after radiation treatment
图2 保护剂处理对辐射后栀子插条生根数的影响Fig.2 Effects of protective agents on root number of gardenia cuttings after radiation treatment
2.2.3 保护剂对辐射后栀子插条成株率的影响 由表4 可知,不同保护剂处理对不同辐射剂量下的栀子插条成株率影响不同。0~10 Gy 辐射处理,除0 Gy 辐射剂量下0.30 g·L-1Cys 处理时成株率显著低于对照,其余经保护剂处理组均无显著差异。20 Gy 辐射剂量下3.00 g·L-1NaCl 处理组栀子插条成株率比对照显著提高了27.31 个百分点,而5.00 g·L-1NaCl 及0.12 g·L-1Cys 处理组成株率显著低于对照其他保护剂处理组保护效应不显著。说明在20 Gy 辐射剂量时,3.00 g·L-1NaCl 处理对辐射后插条具有保护作用,而5.00 g·L-1NaCl 及0.12 g·L-1Cys 处理加剧了对辐射后插条的损伤作用。40 Gy 辐射剂量下,0.12 g·L-1Cys 处理组成株率比对照显著提高了15.08 个百分点,0.08 g·L-1Vc 处理组成株率比对照提高了17.10个百分点。由此可知,3 种保护剂对栀子插条成株率总体表现为高剂量辐射下具有保护效应,而低剂量辐射下保护作用不显著。
2.2.4 保护剂对辐射后栀子节间长度的影响 由图3 可知,对照组节间长度随着辐射剂量的增加,逐渐减小。不同保护剂处理对不同辐射剂量下的栀子节间长度影响存在差异。其中未经辐射处理组各保护剂处理间无显著性差异。大于10 Gy,NaCl 不同浓度开始呈现出保护作用。20 Gy 辐射剂量时,3.00 g·L-1NaCl 处理显著提高了植株节间长度,是对照的1.46 倍,而相同保护剂处理对5 Gy 辐射后栀子节间长度具有抑制作用。40 Gy 辐射剂量下,0.12 g·L-1Cys 和0.08 g·L-1Vc 处理显著提高了植株节间长度,分别是对照的1.46 和1.50 倍;而5 和20 Gy 剂量辐射下,0.30 和0.12 g·L-1Cys 处理显著降低了植株节间长度。结果表明Cys 对高剂量辐射处理具有较好的保护效应。
2.2.5 保护剂对辐射后栀子分枝数的影响 由图4可知,3 种不同浓度保护剂在不同辐射剂量下对栀子分枝数的影响不同。20 Gy 辐射剂量下,与对照相比,3.00 g·L-1NaCl 处理组分枝数显著增加了42.91%,而5.00 g·L-1NaCl 处理分枝数显著减少。Cys 浸泡处理对0~10 Gy 辐射后栀子分枝数影响不明显;20 Gy 处理下,0.12 g·L-1Cys 处理组分枝数明显减少;40 Gy 辐射剂量下,0.18 g·L-1Cys 处理组分枝数较对照显著增加了69.17%。20 Gy 辐射剂量下,0.08 g·L-1Vc 浸泡辐射后插条,分枝数相比对照显著增加了32.39%;40 Gy 辐射剂量下,Vc 各处理组分枝数随浓度升高呈递增趋势。说明高剂量辐射下适宜的Vc 浓度通常也较高。
表4 保护剂对辐射后栀子插条成株率的影响Table 4 Effects of protective agents on planting rate of gardenia cuttings after radiation treatment /%
图3 保护剂对辐射后栀子节间长度的影响Fig.3 Effects of protective agents on internode length of gardenia after radiation treatment
2.2.6 保护剂对辐射后栀子叶片数的影响 由图5可知,NaCl 与Vc 浸泡0 ~10 Gy 辐射后栀子叶片数变化不明显。在5 Gy 辐射剂量下,0.30 g·L-1Cys 处理组叶片数显著低于对照。20 Gy 辐射剂量下,3.00 g·L-1NaCl 和0.08 g·L-1Vc 处理组叶片数分别比对照显著增加了32.74%和28.95%;而5.00 g·L-1NaCl 和0.12 g·L-1Cys 处理组叶片数相比对照显著减少。40 Gy 辐射剂量下,5.00 g·L-1NaCl、0.12 和0.30 g·L-1Cys 以及0.08 g·L-1Vc 处理组叶片数比对照分别显著增加了43.38%、87.45%、34.87%和120.08%;而0.05 g·L-1和0.07 g·L-1Vc 处理组叶片数相比对照显著降低,说明高剂量辐射下对叶片数促进效果较好的保护剂通常浓度也较高。
图5 保护剂处理对辐射后栀子叶片数的影响Fig.5 Effects of protective agents on leaf number of gardenia after radiation treatment
2.2.7 保护剂对辐射后栀子叶长、叶宽的影响 由图6 可知,在0~20 Gy 辐射剂量下,除0.30 g·L-1和0.12 g·L-1Cys 分别在5 Gy 和20 Gy 对栀子叶长有显著抑制作用,其他保护剂处理组与对照组均无显著差异。40 Gy 辐射剂量下,NaCl 除3.00 g·L-1处理组全部死亡,其他浓度处理组栀子叶片长度均显著增大,说明NaCl 对高剂量辐射下的栀子叶片长度具有保护作用。0.12 g·L-1和0.30 g·L-1Cys 处理组栀子叶长相比对照显著增加了107.41%和57.61%。Vc 除0.07 g·L-1处理组栀子叶长最低且显著低于对照,其他浓度从低到高处理组叶长比对照分别显著增加了19.34%、23.87%和83.13%。
图6 保护剂处理对辐射后栀子叶片长度的影响Fig.6 Effects of protective agents on leaf length of gardenia after radiation treatment
图7 保护剂处理对辐射后栀子叶片宽度的影响Fig.7 Effects of protective agents on leaf width of gardenia after radiation treatment
由图7 可知,Cys 和Vc 对0~20 Gy 辐射剂量下栀子叶宽影响不明显。NaCl 对0 ~10 Gy 辐射剂量下栀子叶宽影响不明显。20 Gy 辐射剂量下,3.00 g·L-1NaCl 处理组叶宽显著比对照高50.35%。40 Gy 辐射剂量下,NaCl 各浓度影响同叶长,分别比对照显著提高了56.70%、34.02%和51.55%。0.12 g·L-1和0.30 g·L-1Cys 浸泡40 Gy 辐射后插条,栀子叶宽显著比对照提高76.29%、37.11%。而0.18 g·L-1浓度处理组相比对照显著减小。Vc 在0.08 g·L-1浓度浸泡40 Gy辐射后插条,栀子叶宽比对照显著增大60.82%。而浓度0.07 g·L-1处理组栀子叶宽显著低于对照。
由表5 可知,辐射后栀子叶片形态均发生了变异,主要表现为叶缘波浪、残缺、叶片卷曲、叶尖端二裂、三裂、叶柄细长呈心形小叶等(图8)。随着辐射剂量的增加,叶片形态变异率逐渐增大。40 Gy 辐射剂量组,成活植株极少,且几乎每株叶片都发生了形态变异。说明高剂量辐射下栀子叶片形态变化大。
表5 辐射及保护剂处理对栀子叶片形态变异率的影响Table 5 Effects of radiation and protective agent treatment on leaf morphological variability of gardenia /%
图8 辐射及保护剂处理对栀子叶片形态的影响Fig.8 Effects of radiation and protective agent treatment on leaf morphology of gardenia
由表5 可知,与对照相比,未辐照处理组经保护剂处理后叶片发生了变异。NaCl、Cys 与Vc 均有不同浓度处理组叶片形态发生了改变。其中0.18 g·L-1Cys处理组叶片变异率最高为18.16%。说明保护剂处理对栀子叶片形态变化有一定的影响,Cys 对未辐照组栀子叶片形态变化影响更大。5 Gy 辐射剂量下,0.08 g·L-1Vc 处理组叶片形态变异率最高,相比CK1提高11.74 个百分点,比CK2提高10.54 个百分点。10 Gy辐射剂量下2.0 g·L-1NaCl 处理组栀子叶片形态变异率最高,比CK1提高20.97 个百分点,比CK2提高18.46 个百分点。20 Gy 辐射剂量组经0.30 g·L-1Cys处理后栀子叶片形态变异率最高,比CK1提高34.39个百分点,比CK2提高27.99 个百分点;经3.00 g·L-1NaCl 处理栀子叶片形态变异率较CK1提高16.82 个百分点,比CK2提高10.42 个百分点。说明0.30 g·L-1Cys 和3.00 g·L-1NaCl 处理在20 Gy 辐射剂量下对叶片形态变异率有一定提高作用。40 Gy 辐射剂量下经保护剂处理后的成活栀子叶片形态变异率均较高,且明显高于20 Gy 辐射下各处理组。0.12 g·L-1Cys 处理栀子叶片形态变异率为85.71%,0.08 g·L-1Vc 处理组叶片形态变异率为83.33%。表明0.12 g·L-1Cys 和0.08 g·L-1Vc 处理在40 Gy 辐射剂量下,不仅能提高植株成活率,也能保证栀子叶片形态变异效果。
辐射诱变育种可大幅度提高突变频率。研究表明经射线处理人工诱导的突变频率比自然突变频率高几百倍甚至几千倍[11],在无性繁殖的观赏花卉中已成为主要育种技术[18]。辐射诱变育种成功的关键在于确定辐射源、辐射剂量、剂量率[19-22]。本研究采用60Co-γ 射线辐射栀子插条,得到半致死剂量为81.65 Gy,半生根剂量为21.22 Gy,半成株剂量为20.30 Gy。根系是吸收养分和水分的重要器官,可进行一系列有机化合物的合成,对地上部分的形态建成和生长代谢过程有重要作用[23]。本研究中生根插条后期生长仍受到抑制,因此建议栀子插条辐照诱变适宜剂量选择半成株剂量附近,即20 Gy 左右,与徐宏等[24]辐射诱变选育栀子新品系得到的结果相同,说明观赏型栀子变种与野生栀子60Co-γ 射线辐射插条的诱变效应可能相同。辐射诱变处理不仅诱发突变,而且会造成不良损伤[25-26]。本试验中栀子插条生根率及成株率在40 Gy 辐射剂量下仅为1.59%,而5 Gy 辐射剂量对栀子插条具有一定的刺激作用。这与黎熠睿等[27]研究电子束转靶X 射线对唐菖蒲生长发育具有低促高抑作用结果一致,与Gudkov 等[28]发现的低剂量辐射5 ~20 Gy(种子辐射)或1 ~5 Gy(营养植物辐射)能促进植物的生长发育的结论也一致。
最佳浓度的保护剂是获得最佳保护效果的关键[15]。本试验采用不同浓度的NaCl、Cys、Vc 浸泡不同剂量60Co-γ 射线辐射后的栀子插条,发现3.00 g·L-1NaCl 处理在20 Gy 辐射剂量下生根率与成株率相比对照均显著提高,且对栀子插条生根数、根长,植株节间长度、叶片数、分枝数、叶宽等生长形态指标均有较好的保护效果。0.12 g·L-1Cys 和0.08 g·L-1Vc处理在40 Gy 辐射剂量下使插条生根率和成株率分别比对照显著提高了1.6 倍和4.6 倍以上,对栀子插条生根数、根长,植株节间长度、叶片数、叶长、叶宽等生长形态指标均有较好的保护效果。王会全等[29]研究NaCl 胁迫对不同品系火龙果种子萌发及枝条扦插的影响发现NaCl 浓度为3 g·L-1时平均每株的生根数达最大,且生根率和成活率也较高,与本研究结果一致。而40 Gy 辐射剂量下,Gys 及Vc 对栀子的保护作用与曾昭琪等[14]发现L-半胱氨酸对栅列藻的辐射受损有明显的防护效果,张再君等[30]、柳学余等[31]发现抗坏血酸对辐射后小麦具有防护作用的结论相同。本研究中,3 种保护剂对栀子插条辐射均有一定保护作用,且对高剂量辐射处理保护效果显著,对低剂量辐射处理保护效果不显著。与傅春玲等[16]发现Vc 对中、高剂量γ 射线损伤具有一定防护作用的结论一致。此外,本研究发现高剂量辐射处理下适宜的保护剂浓度也较高,与管振谦等[32]发现高浓度(120×10-6以下)的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP),细胞色素C 水溶液浸泡高剂量γ 射线及加速电子辐射的向日葵种子时作用更明显的结果相同。
此外,5~20 Gy 辐射剂量处理下CK2叶片形态变异率较CK1有所增加,推测可能由于泡水后,进入植物内部的H2O 在原有自由基的作用下,产生了更多的自由基,但具体机理有待深入研究。
本研究采用不同剂量60Co-γ 射线辐射栀子插条,发现低剂量辐射对栀子插条具有一定促进作用,随着辐射剂量增加,对栀子插条的损伤作用增大,适宜的辐射诱变剂量为20 Gy 左右。经NaCl、Cys 及Vc 3 种保护剂不同浓度浸泡辐射后栀子插条,不同辐射剂量下,适宜保护剂的种类和浓度各不相同。辐射剂量为20 Gy 时,最适保护剂为3.00 g·L-1NaCl;40 Gy 辐射剂量下,Cys 和Vc 保护效果更好。3 种保护剂对栀子插条均有一定的保护作用,但其在栀子插条内的作用机理还有待深入研究。