欧李种质叶片类黄酮含量及不同组分特征研究

任玉琴 付鸿博 雷 晨 王鹏飞 穆霄鹏 张建成 杜俊杰

(1山西农业大学园艺学院，山西 太谷 030801；2黑龙江省农业科学院乡村振兴科技研究所，黑龙江 哈尔滨 150000)

欧李[Cerasus humilis(Bge.)Sok.]是蔷薇科樱桃属的极矮生灌木果树[1]，丛状生长，树高0.5 ～1 m，枝长0.5 m。欧李花色多种，果色、果形各异，叶片大小、形状不同，具有很高的观赏价值，是我国特有的野生果树之一[2]。欧李在我国十多个省份均有种植，其果实可食用、 加工，根、种子可入药，叶片含有儿茶素(catechin，CC)、表儿茶素(epicatechin，EC)、芦丁(rutin，RT)和甘草素(liquiritigenin，LG)等功能物质，可用于生产绿茶和发酵茶等各种保健茶，以及其他功能性产品[3]，具有良好的生态、观赏、经济和药用保健价值。

类黄酮又称生物类黄酮，是自然界植物中主要活性成分之一，广泛存于水果、蔬菜、谷物、根茎、树皮、花卉、茶叶和红葡萄酒中[4]。类黄酮作为一种重要的次生代谢产物，对多种细菌、真菌、病原体等致病微生物有抑制作用[5]，同时具有扩张血管、降糖降脂、美白等功效[6]，有较高的实用开发价值[7]。儿茶素、 表儿茶素广泛存在于药材和茶叶等植物和植物性食物中[8-9]，属于黄烷-3-醇类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善糖尿病和神经退行性病变、调节免疫功能等生物活性[10-12]。黄舒婷等[13]通过对钩藤叶进行抗氧化活性部位追踪，发现钩藤叶抗氧化活性主要与黄酮和多酚等成分相关。孙建瑞等[14]发现豫西山茱萸叶黄酮具有显著的抑菌和抗氧化能力。崔树梅等[15]指出根皮素具有抗氧化、抗炎、美白、防晒、抑菌、保湿等多种功效，已被应用于化妆品。研究发现欧李果实具有显著的抗氧化能力[16-17]，但对叶片类黄酮组分含量研究较少，使叶片功能未得到广泛开发。

基于前期研究结果，本研究选定38 份欧李叶片种质中含量较高和种质间差异较大的9 种生物活性组分(儿茶素、表儿茶素、甘草素、芦丁、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、杨梅素、光甘草定、根皮素)进行测定，并对其抗氧化能力及酪氨酸酶抑制率进行分析，旨在为欧李后期相关物质的检测及提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2019年7—10月，自山西农业大学园艺站和欧李种质资源圃采集38 份欧李种质资源，每份欧李种质选取3 株植株，每株采集15 ～20 片基生枝中部成熟期叶片，采后的叶片除杂放于-40℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验仪器及试剂 U3000 超高效液相色谱仪，美国Thermo 公司；UV-5200 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SB25-12D 超声清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。色谱级甲醇、乙腈均为Merck 品牌，CC、EC、LG、RT、槲皮素(quercetin，QC)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(quercetin -7-O- glucoside，Q3G)、杨梅素(myricetin，MC)、光甘草定(glabridin，GB)、根皮素(phloretin，PR)标准品，北京索莱宝生物科技有限公司，纯度≥98%。分析纯甲醇，天津市天力化学试剂有限公司；盐酸、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2.2 样品提取、制备及组分测定 提取液的制备:利用超声辅助提取法[17-18]，用液氮将保存备用叶片研磨成粉末，用40%的酸化甲醇作提取液，料液比1 ∶10(g ∶mL)，漩涡震荡混匀，超声提取30 min(40 kHz)，然后于10 000×g离心15 min，取上清液，共提取3 次，合并上清液，待测。

类黄酮含量(flavonoid content，FC)测定:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法测定。吸取0.3 mL 提取液于10 mL 容量瓶，先加0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，避光静置6 min，再加0.3 mL 10%六水硝酸铝溶液，摇匀，避光静置6 min，最后加4 mL 4%氢氧化钠溶液，用40%甲醇定容至10 mL，摇匀静置10 min，在510 nm 波长处测定吸光度值。以标准品芦丁做标准曲线。

类黄酮组分测定:采用超高效液相色谱仪测定欧李叶片黄酮组分，取1 mL 提取液过0.22 μm 微孔滤膜后，装于液相进样瓶中待测定，使用美国安捷伦Agela Venusil ABS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱子。

流动相:A 相0.5%甲酸水，B 相乙腈，进样量20 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脱程序:0 mim，10%乙腈；0～5 min，13%乙腈；5 ～25 min，16% 乙腈；25 ～30 min，21%乙腈；30 ～45 min，22%乙腈；45 ～50 min，24%乙腈；50～65 min，25%乙腈；65～66 min，10%乙腈；平衡3 min。检测波长280 nm 和360 nm，测定CC、EC、LG、RT、MC、LG、Q3G；

表1 38 份欧李种质采集地点和日期Table 1 Collection location and date of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

流动相:乙腈∶水＝60 ∶40，进样量20 μL，检测波长280 nm，测定GB。

流动相:A 相0.02%甲酸水，B 相甲醇，进样量10 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脱程序:0 mim，10%甲醇；0～5 min，20%甲醇；5 ～10 min，35%甲醇；10 ～20 min，40%甲醇；20 ～35 min，75%甲醇；35 ～40 min，10%甲醇；平衡5 min。检测波长280 nm，测定PR。定性分析根据标准品的保留时间确定、定量分析采用标准曲线法。

1.2.3 抗氧化能力测定 1，1-二苯基-2-三硝基苯胁(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法[17]测定抗氧化能力。样品组:吸取0.2 mL 样品稀释液，加入2.8 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液，室温避光反应30 min；空白组:用40%甲醇替代样品稀释液。于517 nm波长处测定吸光度值，蒸馏水调零。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率测定[19]分别配制pH 值6.8 的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、1.0 mg·mL-1的L-酪氨酸溶液和0.1 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液。按照以下配比加样，测试样1:2.0 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；测试样2:2.5 mL PBS＋0.5mL 酪氨酸酶溶液；测试样3:0.5 mL 样品溶液＋1.5 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；测试样4:0.5 mL 样品溶液＋2.0 mL PBS ＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液。将各测试样混匀，将每个样品的1 ～4 种测试样混匀，37℃水浴30 min，立即取出在475 nm 波长处测定吸光度值(A1～A4)。按照公式计算提取物对酪氨酸酶抑制率:

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007、SAS 9.2 等软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同种质欧李叶片类黄酮含量变异分析

由表2 可知，38 份欧李种质叶片类黄酮的平均值为33.235 mg·g-1，变异系数为41.669%，超过了20%，表明欧李叶片类黄酮的变异较大，遗传多样性丰富。38 份种质叶片中CC 含量范围在6.271 ～935.295 mg·100g-1之间，平均值为304.141 mg·100g-1，在黄酮类化合物中含量占比接近10%，明显高于其他已测组分含量，且变异系数超过了20%，达到了80.894%。EC、LG、RT、Q3G 含量的平均值分别为43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而MC、QC、GB 和PR 含量的平均值仅为4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明显低于其他组分，表明在已测的类黄酮化合物组分中，MC、QC、GB 和PR 含量较低，但各物质的变异系数均达到60%以上，说明38 份欧李种质叶片中类黄酮各组分含量的变异较大，遗传多样性丰富。

表2 38 份欧李种质叶片类黄酮及不同组分含量变异分析Table 2 Analysis of flavonoids and different components in leaves of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

2.2 不同欧李种质叶片类黄酮含量的聚类分析

依据欧李叶片类黄酮含量，对38 份欧李种质进行聚类分析，如图1 和表3 所示。将欧李种质分成可大类，其中:第Ⅰ类超高类黄酮含量种质1 份，含量为64.84 mg·g-1；第Ⅱ类高类黄酮含量种质5 份，含量在48.38～55.67 mg·g-1之间；第Ⅲ类中类黄酮含量种质28 份，含量在19.21 ～47.83 mg·g-1之间；第Ⅳ类低类黄酮含量种质4 份，含量在3.29 ～9.33 mg·g-1之间。其中第Ⅲ类占比相对较高，为73.68%。表明38 份欧李种质类黄酮含量主要集中在19.21 ～47.83 mg·g-1之间。

2.3 不同种质欧李叶片黄酮类物质含量分析

图1 不同种质欧李叶片类黄酮含量的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of leave flavonoid content of different Chinese Dwarf Cherry Germplasms

表3 不同类黄酮含量类型的欧李种质Table 3 Different flavonoid content types in of Chinese dwarf cherry germplasms

对不同种质欧李叶片中黄酮类物质含量进行测定，由表4 可知，9 种物质在不同种质叶片间含量有极显著差异。其中CC、EC、RT、Q3G 在38 份种质中均能检测到，CC 含量在6.27 ～935.29 mg·100g-1之间，高于另外3 种物质，且变化范围最大。LG 在除15-02、15-01、15-51、XLN19-1 4 份种质以外的34 份种质中均被检测到。在除DG-7、XLN19-01、Ft-1 3 份种质以外的35 份种质中检测到，含量在0.00 ～12.04 mg·100g-1之间。有11 份种质中不含，其含量在0.00 ～19.67 mg·100g-1之间。GB 含量较低，且仅在9 份种质中检测到，含量最高为0.19 mg·100g-1，在9种物质中含量最低，且变化范围最小。PR 在8 份种质中未检测到，且含量较低，最高含量仅为16.00 mg·100g-1。

2.4 不同种质欧李叶片类黄酮和不同组分与DPPH自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相关性分析

通过对38 份欧李种质叶片的类黄酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率进行相关性分析发现(图3)，欧李叶片的类黄酮与MC 和QC 呈负相关，与CC、EC、RT、Q3G 呈极显著正相关，其中CC、EC、RT 与类黄酮含量的相关系数都接近0.6。类黄酮含量与DPPH 自由基清除率呈极显著正相关，与酪氨酸酶抑制率呈正相关，但相关系数仅为0.13，表明类黄酮中对酪氨酸酶起抑制作用的物质含量较低。在9种组分中，除MC、QC、GB 和PR 外，其他5 种组分与DPPH 自由基清除率均呈极显著正相关，RT 与DPPH自由基清除率正相关系数最大，达到0.67，表明RT 可能是欧李叶片抗氧化活性的主要成分之一。9 种类黄酮组分与酪氨酸酶抑制率相关系数较低，表明9 种组分对酪氨酸酶抑制作用较差。MC 和QC 与除GB 和PR 外其他5 种组分均呈负相关，但MC 与QC 之间呈极显著正相关，且二者与DPPH 自由基清除率呈负相关。DPPH 自由基清除率与酪氨酸酶抑制率间呈负相关，表明欧李叶片抗氧化和美白之间可能无相关性。

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图2 不同种质欧李叶片类黄酮和不同组分与DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of flavonoids and components in leaves of different Chinese dwarf cherry germplasms with DPPH clearance rate and tyrosinase inhibition rate

3 讨论

欧李叶片叶形多样，常呈倒卵圆形，叶互生，呈螺旋状排列。叶片上半部宽、下半部窄是欧李区别于其他近缘种(如郁李、麦李)的重要标志。黄酮类化合物是植物次生代谢产物，广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实中，是许多中草药的有效成分[20]，由于其生理活性多种多样，近年来引起了国内外化学家、药物学家的广泛重视。

本研究测定了38 份欧李种质叶片的类黄酮、儿茶素、表儿茶素、芦丁、杨梅素等生物活性物质，并对38份种质类黄酮及各组分进行变异分析，发现各物质的变异系数均超过了20%，表明欧李类黄酮及各组分的变异较大，遗传多样性丰富。38 份欧李叶片种质中，类黄酮的含量变化范围为3.29 ～64.84 mg·g-1，儿茶素含量范围为6.27 ～935.29 mg·100g-1，平均含量在黄酮类化合物中占比接近10%，高于其他已测组分含量。本研究前期通过对欧李不同种质果实的类黄酮及各组分含量进行测定，发现成熟期果实类黄酮含量显著低于叶片[21-22]。李国莉等[23]研究表明宁夏枸杞叶片中黄酮含量大于枸杞果实。薛晓芳等[24]比较了枣和酸枣不同器官黄酮含量并分析了抗氧化能力，发现成熟叶片总黄酮含量为7.01 ～9.02 mg·g-1，平均值为7.98 mg·g-1； 且叶片中总黄酮含量高于果实，这与本研究结果一致。

表儿茶素、甘草素、芦丁、槲皮素7-O-葡萄糖苷含量的平均值分别为43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而杨梅素、槲皮素、光甘草定、根皮素含量的平均值仅为4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明显低于其他组分的含量。其中儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷在38 份种质中均能检测到，而有11 份种质中不含有槲皮素。付桂香等[25]比较了7 个不同种质沙棘叶片3 种黄酮类物质的含量，发现芦丁的含量范围为9.47 ～389.17 mg·100g-1，且7个种质中都可以检测到，而槲皮素含量为5.59 ～16.35 mg·100g-1，仅在3 个种质中检测到。陆胜波等[26]对泡核桃不同器官的黄酮及组分进行测定，发现泡核桃叶片中芦丁含量显著高于槲皮素和杨梅素，这与本研究一致，但泡核桃叶片中不含有表儿茶素，且儿茶素含量显著低于芦丁，表明不同物种间黄酮类物质含量间存在差异。

本研究通过对38 份欧李种质叶片类黄酮含量进行聚类分析，将其分成了四大类，其类黄酮含量大多集中在中类型种质中，占比超过了80%，表明大多数种质叶片类黄酮含量较高。

本研究对38 份欧李种质叶片的类黄酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率进行相关性分析发现，欧李种质叶片的类黄酮与杨梅素和槲皮素呈负相关，与其他7 种组分呈正相关。类黄酮含量与DPPH 自由基清除率呈极显著正相关，且儿茶素、表儿茶素与抗氧化活性呈极显著正相关。李鑫等[27]研究发现，酚酸及黄烷-3-醇类物质与抗氧化活性呈显著正相关，说明这两类物质在苹果的抗氧化活性中可能起主要作用。这与本研究中儿茶素和表儿茶素等黄烷醇类物质与DPPH 自由基清除率呈显著正相关结果一致。王临宾等[28]对苹果叶的多酚纯化后，发现苹果叶多酚对DPPH 自由基清除能力有所增强。王磊[29]对天津等地14 种果树叶的黄酮进行提取，发现其均有抗氧化和抑菌效果，表明部分黄酮类物质有抗氧化效果，与本研究结果相同。

欧李叶片根皮素与酪氨酸酶抑制率呈负相关关系，且欧李叶片类黄酮抗氧化能力与酪氨酸酶抑制率之间呈负相关性，表明欧李叶片抗氧化和美白之间可能无相关关系。张国文等[30]发现根皮素对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，是一种潜在的可逆混合型酪氨酸酶抑制剂。而本研究发现根皮素与酪氨酸酶抑制率呈负相关关系，可能是因为本研究中种质较少，且根皮素含量较低。宋建平等[31]发现三七叶黄酮提取物具有抗氧化能力，并且可以抑制酪氨酸酶活性，而抗氧化能力与抑制酪氨酸酶活性之间呈负相关性，表明三七叶的抗氧化作用是否与其美白功效有关，还需进一步研究。

4 结论

本研究通过测定38 份欧李种质叶片类黄酮及9种(儿茶素、表儿茶素、甘草素、芦丁、槲皮素、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、杨梅素、光甘草定、根皮素)活性物质含量，并分析其抗氧化及酪氨酸酶抑制率能力，确定了欧李03 - 25 品种的儿茶素含量最高为935.29 mg·100g-1，且儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷与DPPH 自由基清除率呈极显著正相关，表明其抗氧化能力较强；芦丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、光甘草定与酪氨酸酶抑制率有正相关关系。本研究为欧李后期叶片中抗氧化及抑制酪氨酸酶活性物质的提取提供了理论依据，同时有利于欧李叶片功能产品的开发。