环状RNAs 与类风湿关节炎骨破坏潜在关系的研究

王 杰，刘 健，文建庭，王 馨，杜新雷

（安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥 230031）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要在老年人中出现的慢性自身免疫性疾病［1］，其中骨破坏是在RA 病程中一直伴随的病理改变，是RA 患者致畸致残的主要原因［2］，大部分RA 患者破骨细胞途径被异常的免疫状态激活，并伴有慢性炎症，导致关节周围骨质疏松和局部骨质破坏［3］。此外，研究表明骨髓破环是RA 骨破坏发展的重要环节，RA 患者骨髓中有大量的免疫细胞形成类似生发中心的聚集物，可发生“关节外”的病理过程［4］。

经大量研究证实，非编码RNAs（ncRNAs）在炎症和自身免疫调节中起着关键作用，主要包括microRNA（miRNAs）、长链非编码RNA（lncRNAs）和环状RNA（circRNAs）［5］。其中，lncRNAs 指长度超过200 个核苷酸且没有蛋白编码能力的RNA［6］，与RA 发展也有重要联系，目前已发现大量的lncRNAs 在RA 中表达异常，并与RA 的疾病活动性相关［7］。Liu 等［8］通过研究发现lncRNACASC2过表达可能通过下调IL-17 降低RA 免疫炎症以达到缓解RA 症状的作用。

circRNAs 已被发现是免疫系统中重要的基因调节器，与自身免疫性疾病的发生和发展密切相关［9］。在20 世纪70 年代，首次在植物病毒中发现了闭合环状的RNA，无游离端。此外，circRNAs 在样品加工过程中容易被选择性富集，使它们比其他类型的RNA 更适合作为生物标志物［10］。

1 circRNAs 概述

1.1 circRNAs 结构特征

目前相比较于其它ncRNAs，人们对circRNAs了解非常少。circRNAs 是没有5'帽子和3'poly（A）尾巴结构的共价键形成的环状单链。这些独特的单链分子是通过在多种真核和原核生物甚至病毒中对pre-mRNA 进行反剪接而产生的。circRNAs不仅通过调节miRNAs 和蛋白质活性，还通过影响转录或剪接，在分子途径的调节中起着重要作用［11］。目前，随着深度RNA 测序（RNA-seq）技术和新型生物信息学方法的发展，已经有超过3 万个环状RNAs 被鉴定出其独特的结构，并因其高度的生物学和功能价值而受到越来越多的关注。circRNAs 对外切酶RNase R 具有抗性，比lncRNAs 更容易保持稳定性。

1.2 circRNAs 常见分类

目前circRNAs 根据基因组的来源以及构成序列可分为4 种类型：（1）大部分是外显子来源的circRNAs（exonic circ RNAs，ecircRNAs）；（2）小部分是内含子来源的circRNAs（intronic circRNA，ciRNAs）；（3）还有一部分是外显子和内含子共同形成的circRNAs（exon-intron circ RNA，EIciRNAs）；（4）最后一类是来自于基因内和基因间的circRNAs［12，13］。

1.3 circRNAs 在生物体内的功能

部分含有miRNA 结合位点的circRNAs 被称为“超级海绵”，主要是由于其与其他竞争性内源性RNAs（ceRNAs）相比，更能与miRNA 相互作用，调节其生物学功能，从而影响其下游靶基因的表达和功能［12，14］。例如circRNA002136 可以通过miR138靶向调节CTLA-4 和PD-1，从而成为潜在的免疫治疗靶点［15］；circRNA0076248 可通过调控miR-181a介导的p53 和SIRT1 的表达参与免疫应答［16］。

2 骨破坏是RA 的重要病理特征

RA 的症状主要是伴有关节软骨和骨骼破坏的滑膜炎［17］，其是导致成骨细胞与破骨细胞之间代谢不平衡、骨吸收增加、骨组织遭受破坏的重要原因［18］。正常人体骨代谢是一个相对平衡的状态，主要由骨破坏和骨吸收共同维持。RA 患者的骨破坏与病程进展相互作用、相互影响，造成破骨细胞和成骨细胞功能紊乱，动态水平失衡，进而加重骨质破坏［19］。因此在研究RA 骨破坏时，需重点关注RA患者成骨细胞与破骨细胞的功能活动，以及骨髓干细胞的的分化等情况。

3 circRNAs 与RA 的关系

circRNAs是一类新型的RNA，可作为临床血液标本的生物标志物。然而，circRNAs在RA中的作用还没有得到广泛的研究。 Luo 等［20］研究表明circRNA0000175、circRNA0008410 以及circRNA0000175和circRNA0008410联合检测可提高RA的诊断准确率。此外，circRNA0000175和circRNA0008410 的表达水平与RA 的疾病活动性和严重程度相关。根据Wen等［21］研究发现RA 患者外周血单个核细胞中circRNA0001200、circRNA0001566、circRNA0003972和circRNA0008360 的表达可能是RA 诊断的潜在生物标志物，这些circRNAs 可能影响RA 的发生发展。因此可以认为将来RA 的诊断以及疾病发展程度可以从circRNAs入手。

4 circRNAs 与RA 骨破坏的潜在关系

4.1 circRNAs 与成骨细胞分化

骨是一种极具活力的组织，其一生中都在经历不断的重塑，但由于骨破坏或缺损，骨的再生或增强能力难以持续。骨的稳态是由多个成骨细胞和破骨细胞在一个连续的吸收和形成周期中维持的［22］。

目前对circRNAs 在骨形成过程中调控机制尚不清楚，研究较少。Zhang 等［23］研究circRNAs 在成骨细胞分化过程中出现的表达谱时，发现抑制circRNAIGSF11 的表达可以促进成骨细胞的分化，增加了miR-199b-5p 的表达。故可以认为circRNAmiRNA 可以在一定程度上对骨髓干细胞的成骨分化具有促进功能。有研究将人骨髓间质细胞在成骨或成软骨培养基中维持7 d，利用RNA 杂交阵列鉴定哪些circRNAs 差异表达［24］。研究发现在早期软骨形成中，起源于SMYD3 基因的circRNAs 可能发挥重要作用，导致miR-181a-5p、miR-181b-5p 和miR-671-5p 高表达。然而，由于SMYD3 蛋白已经与miRNA 的特异性转录调控相关，这种关联是否通过miRNA 海绵活性的降低而存在还有待证实。

Qian 等［25］检测在BMP2 诱导MC3T3-E1 细胞成骨分化前后circRNAs 的差异表达，发现circRNA19142、circRNA5846 不仅通过 miRNAmRNA 影响成骨分化过程，还与成纤维细胞生长因子、Wnt 信号通路等有潜在联系。Ouyang 等［26］采用碱性磷酸酶和茜素红染色法检测circRNA0074834对骨髓干细胞成骨分化的调控作用。研究发现circRNA0074834 通过miRNA-942-5p 作为调节ZEB1和VEGF 表达的ceRNA，可以促进成骨分化。Wen等［27］通过研究发现circRNA0076906 通过调节miR-1305/ OGN 通路，诱导成骨细胞分化，从而达到缓解骨破坏的目的。

上述5 例试验研究结果并不完全相同，其circRNAs 对成骨细胞分化作用结论略有不同：有通过circRNA-miRNA 影响分化，也有通过miRNAmRNA 进行影响，还有通过对信号通路的影响。结论有所差异可能与骨破坏患者病情轻重、检测手段等不同有关，但是可以明确部分circRNAs 对骨破坏的成骨细胞分化有确切作用，可以为更好地了解成骨分化过程打开一扇新的窗口，同时也为今后寻找治疗和诊断RA 骨破坏潜在有效靶点提供了新的途径。

4.2 circRNA 与破骨细胞分化

破骨细胞是由通常为单核-巨噬细胞系的前体细胞产生的，在RA 中，破骨细胞的形成和功能会被免疫系统的异常所影响［28］。破骨细胞过度激活会导致骨内环境平衡失调，RA 患者骨代谢紊乱、骨破坏发生都与破骨细胞的分化密不可分。Chen 等［29］通过检测未处理组中circRNAs 的差异表达，分析并鉴定RANKL + CSF-1 处理的骨髓单核/巨噬细胞（bone marrow derived macrophages，BMM）细胞和破骨细胞分化过程中差异表达的miRNA。通过生物信息学分析，miR-195a 可能与circRNA28313 和CSF-1 结合，共同形成circRNA-miRNA-mRNA 网络。circRNA28313 通过ceRNA 网络来缓解miR-195 介导的对CSF1 的抑制，从而调节BMM 细胞中的破骨细胞分化。从circRNAs 调控的角度来探讨RA 患者骨破坏中破骨细胞过度分化将会为以后临床治疗RA 骨破坏提供新得思路。

4.3 circRNA 与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖

RA 骨破坏与骨髓间充质干细胞的增殖与凋亡息息相关，BMSCs 的成骨化、脂肪化以及细胞周期的改变都严重影响着RA 患者骨破坏的发展。然而circRNA 在BMSCs 中的作用及其潜在功能尚不完全明确。BMSCs 具有自我更新和多向分化成脂肪、骨骼和肌肉等多种组织细胞的潜力［30］。此外，BMSCs 对正常骨发育和维持骨代谢至关重要［31］。Ren等［32］使用降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）刺激BMSCs，检测circRNAs 和FOSL2 的表达。研究发现有58 个circRNAs 发生显著差异表达，包括44 个circRNAs 表达下调和14 个表达上调。其中circRNA003795 可以通过海绵化miR-504-3p 间接调控FOSL2 的表达，从而导致BMSCs 增殖的改变。

4.4 circRNA 与骨相关信号通路

最新的研究表明，circRNAs 调控了多种与骨代谢相关的分子和信号通路，通过信号通路调控成骨细胞与破骨细胞之间的平衡，进而能够影响RA 骨破坏发展。目前已知Wnt/β-catenin、mitogen-activated protein kinases（MAPKs）、BMPs、Toll-like receptors（TLRs）、estrogen receptor β（ERβ）等信号通路都与成骨细胞与破骨细胞之间的平衡有关［33］。Yang 等［34］采用q-PCR 检测成骨标志基因mRNA 表达及BMP 通路主调节基因表达，验证了MAPK 通路对骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。但是circRNAs 对mRNA 以及相关蛋白的调节作用仍需要进一步研究。

4.5 circRNA 与免疫炎症

最近的研究表明，许多细胞因子和免疫细胞具有破骨作用。尽管由于人体免疫网络的复杂性，很难确定它们在病理状态中的确切作用［35］。Li 等［36］通过GEO 数据库比较RA 患者和健康志愿者的mRNA 表达，以识别在滑膜组织中特异表达的基因位点，然后绘制环状circRNA-miRNA-mRNA 的相互作用图。此外，还在体外对候选circRNAs 进行了功能丧失和挽救分析。经研究发现29 个circRNAs差异表达，并且关节腔内炎症活性的降低是通过抑制circRNA0001859 的活动，从而降低ATF2 表达实现的。circRNAs 能够降低RA 患者的免疫炎症反应，因此可以缓解RA 患者骨代谢紊乱，调节成骨细胞与破骨细胞的分化，缓解骨破坏的进程。

5 总结与展望

circRNAs 结构稳定，功能复杂，来源多样，分布广泛。目前有关circRNAs 的研究大多关注circRNA-miRNA-mRNA 的机制、功能，以及相应蛋白的关联。然而，单个circRNA 对一个miRNA 有许多结合位点，可以与多个miRNAs 相互作用，因此，需要更广泛的研究来阐明circRNAs 和miRNAs 之间功能的相互作用。此外，circRNAs 在调节蛋白质翻译和与RNA 结合蛋白在各种疾病中的作用还需要进一步的研究。

综上所述，目前对circRNAs 与RA 骨破坏的研究成果较少，且对ceRNAs 在RA 骨破坏中调节作用机制还尚不明确。关于RA 骨破坏的潜在病理机制，大量研究人员观察到circRNAs 在BMSCs、成骨细胞与破骨细胞分化、分子信号通路、免疫炎症反应的差异表达，并提出了它们之间可能的联系。因此，可以作出假设：circRNAs 在RA 骨破坏的发展中发挥着独特的作用，并可能在RA 骨破坏的治疗中发挥重要作用。解决这些问题可能有助于RA 骨破坏的预防和治疗靶点的开发，故今后的研究应从RA 骨破坏的数据挖掘，筛选相关circRNAs 与细胞因子进行机制研究与干预实验。

作者贡献度说明：

刘健：提出文章主题，负责构思修改文章框架；王杰：主要负责全文撰写，后期的修改；文建庭：负责全文文字的修改，对逻辑关系把控；王馨、杜新雷：负责前期参考文献查找，把控文献质量。