二次谐波成像原理及在眼科中的研究进展

何欢欢 高蓉蓉 王勤美 黄锦海

传统显微镜的分辨率由于受衍射极限和光源的限制已达到极限。1961年，Franken等首次观察到了激光倍频现象，发现将激光器波长调制为694.3 nm的红外激光（基波）照射石英晶体时，有2束激光从晶体中穿出，一束为红外激光，另一束为激光与晶体发生相互作用产生的波长为347.15 nm的紫外激光，紫外激光的频率为基波的2倍，波长为基波的1/2，称之为二次谐波（Second harmonic generation，SHG）现象，根据光波与介质相互作用产生的非线性光学效应可对生物体进行成像和探测。从此，SHG的研究进展迅速，在肌腱、血管和眼部组织得到了应用[1]。现笔者简述SHG的产生原理、成像特点及其眼科应用。

1 SHG成像的原理和特点

波长为λ、频率为ν的入射光作用在介质上时使介质从基态激发为激发态，当从激发态回落到基态时产生1个波长为1/2 λ、频率为2 ν的光波，即SHG。SHG成像源于激光与不同介质的非线性相互作用，信号的强度与激发光的光场强度和介质本身性质有关，所以通过控制激发光光场强度和探测SHG信号强度即可得知介质的电子态、排列方式和旋向等微观结构[1]。

SHG信号的产生需同时满足以下2个条件：①介质为非中心对称结构：角膜基质中的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维、巩膜中致密的胶原纤维[2，3]以及筛板（Laminacribrosa，LC）和视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell，RGC）轴突中的微管（Microtubule，MT）[4]均为高度非中心对称，所以可以产生强信号；②相位匹配条件：传播中的倍频光波和新激发出的SHG保持相位上的一致性才能产生信号。

SHG信号是生物组织产生的原发信号，无需加分子探针即可得到信号值，信号强度的影响因素包括：①介质种类：同一光源照射角膜胶原纤维和肌腱胶原纤维所得的信号强度不同；②胶原纤维的类型：Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原纤维的SHG信号强度各不相同；③激发光偏振方向、光线与胶原纤维形成角度以及成像深度。

SHG显微成像装置主要包括激光发射器、物镜、滤光片组和信号探测系统。在眼科成像中通常选用775～860 nm 的激发光源，在保证产生较强信号的同时避免样品受损。信号收集方式分为前向和背向探测，前向成像较清晰地显示了单个胶原纤维的形状和方向，背向成像虽较模糊但能显示胶原纤维片层的分布。临床上实时观测活体角膜需采用背向信号，无法采集前向成像。因为SHG和双光子荧光（Two-photon excited fluorescence，TPEF）都是二阶非线性现象且空间分辨率相当，成像系统兼容，所以已商品化的TPEF显微镜只需要更换滤光片即可用于实现尚未商品化的背向SHG成像。

SHG成像与传统光学成像技术相比具有以下优点[1]：①近红外激发光源减少了样品的光损伤，而且发生非线性效应，光线不被吸收，减少了热损伤；②样本的制备无需固定、切片和染色，简化了实验流程，避免破坏样本形态和染料的光毒性；③SHG一般只发生在焦点附近的极小区域，对周围样品损伤大大减少，无需使用共焦小孔即可获得三维图像；④分辨率高，具有较高的信噪比，允许在组织的不同深度进行成像，成像深度优于常规技术。

2 SHG成像与其他成像技术的结合

目前对SHG信号了解不够深入，因此通常还需要与TPEF显微镜和共聚焦成像等其他方式结合使用，获得信息互为补充。

2.1 SHG与光学相干断层扫描（OCT）的结合

SHG成像基于组织的非线性光学特性，而OCT则基于组织的线性光学散射特性（折射率）。OCT轴向分辨率高、敏感度高、探测速度快且无创，在眼前节和眼底成像方面已得到广泛应用，在SHG成像中引入OCT，可以提高探测的灵敏度，增加成像深度。但是OCT不能消除焦点以外的杂散光，限制其成像分辨率，SHG在成像质量和光损方面有了明显提高，且侧重于纤维排列，在OCT中引入SHG成像可以发现组织更早期的变化，有利于早期诊断。随着光纤技术的高度发展，SHG-OCT技术可与光纤光学结合，有望实现活体的内窥镜检查。

2.2 SHG与TPEF的结合

SHG是非线性散射，与样品的二阶非线性极化率的空间分布有关，主要呈现胶原纤维；TPEF则是基于荧光发射后的非线性吸收成像，可发射波长为750～826 nm的激发光，通过对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和黄酮类腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）的激发来显像细胞结构[5]。SHG成像和TPEF成像的联合使用，无需任何染料即可显示整个角巩膜的纤维和细胞[6-8]以及视网膜的多种细胞[9]。

3 SHG在眼科中的应用

SHG成像技术可以直观评估眼部的角膜基质、小梁网、巩膜、神经节细胞轴突中的微管等结构，在相关眼病的诊治中已有研究应用。

3.1 角膜基质的SHG成像

基质层占角膜全层的90%，由少量的角膜基质细胞和大量的胶原纤维构成，胶原纤维呈非中心对称柱状结构，在强激光激发下可以产生SHG强信号。Bowman层胶原纤维短且排列方向不规则，前向成像呈明显的点状信号，背向成像呈模糊和漫反射的信号，板层间分支和吻合很多，Bowman层的弧形纤维和锚定纤维有助于固定胶原板层；在前基质层，胶原纤维变宽变长，排列方向更一致但仍随机分布，板层间分支和吻合减少，前向成像呈随机排列的短纤维束，背向成像呈明显交织的薄片；后基质层的胶原束随深度增加变得更长、更宽，方向更规律，分支和吻合进一步减少[10，11]。

3.2 圆锥角膜的SHG成像

SHG可以观察到圆锥角膜患者的中央和旁中央角膜变薄、变陡，插入Bowman层的弓形纤维和锚定纤维减少，Bowman层和胶原纤维断裂，纤维板层分支和吻合明显减 少[12-15]。角膜胶原交联术后，SHG还可以观察角膜胶原纤维的主要排列方向，从而评估交联效果[16]，在角膜基质前1/3最显著，且效果在一定范围内随时间延长而增加[17-19]。

3.3 角膜屈光手术术后的SHG成像

角膜屈光手术后，SHG可以清楚观察到角膜的切削边界和胶原纤维的形态变化，评估手术效果和监测角膜扩张等并发症的出现。Kivanany等[20]使用SHG和TPEF联合检测了板层角膜切削（Lamellar keratectomy，LK）术后细胞和细胞外基质的改变，观察到术后角膜细胞的迁移、纤维化、重塑和再生的全过程：术后在切削平面下发生角膜基质细胞的死亡；术后第7 和第21 天成纤维细胞与胶原板层共同排列，成纤维细胞的移动受胶原板层调控，同时基质细胞分泌细胞外基质蛋白；术后60 d，细胞和基质形成板层结构。

3.4 角膜感染的SHG成像

Robertson等[21]使用SHG成像和多光子荧光显微镜定量研究了离体和在体兔角膜感染期间，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）侵入角膜基质中的定向运动，发现PA的运动方向和胶原纤维的排列方向明显相关，感染多发生在胶原纤维排列方向更一致的角膜中央，PA顺着胶原纤维的走形在纤维间隙通行导致感染扩散，而角膜缘区和巩膜区的胶原纤维分布杂乱，感染不常见。PA浸润最密集的地方引起胶原纤维坏死，背向SHG只能检测到极小的信号。SHG成像显示胶原纤维，多光子荧光显微镜显示PA，二者结合可以获知PA的感染路径和对胶原纤维的破坏程度，有望成为评估角膜微生物感染的的工具[22]。

3.5 网格状角膜营养不良（Lattice corneal dystrophy，LCD）的SHG成像

LCD是淀粉样变性病的典型类型。淀粉样蛋白肽的SHG信号等于甚至高于内源性胶原纤维的信号，可用作生物成像的SHG探针[23]。超短淀粉样蛋白肽是长度为微米级、直径仅7～10 nm的螺旋纤维，形态与胶原纤维相似。SHG显微镜提供了简单且无标记的方法来检测淀粉样蛋白肽，定量分析其取向、形态和亚微米异质性，可用于体内诊断LCD等角膜疾病。与常规荧光成像技术相比，SHG光学穿透力更深、光损伤更低和观察时间更长。

3.6 房水流出通道的SHG成像

小梁网是房水流出的主要路径，SHG可以检测小梁网中胶原纤维的分布，TPEF成像显示小梁网的弹性纤维和代谢活性细胞，二者组合可提供生理状态和显微结构的关键信息，具有明显的对比度和特异性。快速傅里叶分析二次谐波成像（Fast fourier transform-second harmonic generation，FFT-SHG）成像利用2D 空间傅里叶分析，使用纤维取向、间距和厚度等参数来量化小梁网胶原纤维，还可对Schlemm管、虹膜和睫状体的脉管系统进行成像，更好地了解青光眼和角膜的生理病理学[24]。

3.7 巩膜的SHG成像

巩膜由致密且互相交织的胶原纤维和少量的弹性纤维构成，前部与角膜相接，后部分为内外两层，外层移行为视神经鞘膜，内层呈网眼状，RGC轴突由此穿出眼球。大部分胶原纤维都平行于巩膜表面，SHG可对巩膜中的胶原纤维进行在体高分辨率的断层扫描，揭示胶原束的分布和取向[25]。与角膜胶原纤维的板层排列不同，巩膜胶原纤维呈束状排列，且分布更密集无序。巩膜胶原纤维的直径和间隙与角膜基质胶原纤维不同，背向SHG信号更强。由于巩膜不透明，因此部分背向信号可能来自高度散布的巩膜组织的前向信号的反向散射。Zyablitskaya等[3]利用SHG探测了羟基甲基甘氨酸钠进行巩膜治疗性组织交联（Therapeutic tissue crosslinking，TXL）对高度近视眼的治疗效果，观察到TXL导致巩膜胶原纤维束的SHG信号增强和波纹度减少，且具有浓度依赖性。

3.8 视乳头（Optic nerve head，ONH）的SHG成像

在眼后极附近，LC和临近的巩膜组织即视乳头周围巩膜（Periodicity plus smooth，PPS）共同形成了ONH的结缔组织成分。LC是由复杂的、网状阵列的束形成的，大部分束是围绕毛细血管的富含胶原蛋白的结缔组织鞘。LC区域的生物力学复杂，多孔LC的结缔组织密度较低，在脆弱的RGC轴突周围形成应力集中区域，LC的机械变形引起RGC轴突损伤，可能是青光眼发生轴突损伤的最初部位，LC的机械特性在青光眼中起着重要作用[26]。LC很难通过传统成像获得，而SHG可以对LC的每个束进行清晰成像[27]，基于二维离散傅里叶变换（Discrete fouriertransform，DFT）的方法，可以获得束的排列方向的一致程度和分散程度。对整个LC进行三维成像并与生物力学相结合，有助于阐明青光眼的发病机制[28]。PPS的最内层表现出规整一致的径向排列，中部则表现出围绕ONH的胶原纤维的强圆周取向。PPS的胶原纤维结构是决定眼内压引起ONH变形的重要因素。通过SHG和小角度光散射（Small-angle light scattering，SALS）对横向和纵向人类ONH冷冻切片进行成像，量化首选纤维方向（Preferred fibre orientation，PFO）和纤维排列的程度（Degree of fibre alignment，DOFA），发现DOFA在PPS中最高，在LC中相对较低。老年人PPS的DOFA高于年轻人，正常人通常高于青光眼患者[29]。在所有LC中，大多数纤维在整个鼻－颞方向具有优先取向。青光眼LC中的大部分PFO与对照组存在明显差异，且下颞叶LC纤维排列取向更一致。LC内纤维排列的差异可能是青光眼视神经病变所特有的，可能是ONH重塑和（或）塌陷的结果。

3.9 MT的SHG成像

RGC的凋亡以及轴突逐渐丢失是青光眼的典型特征。RGC轴突中的MT为非中心对称分子结构且均匀极化，完整的MT骨架结构可产生强SHG信号，量化RGC活性[30]。微管的二次谐波成像无需使用外源性染色剂或基因工程即可显示视网膜神经纤维束，有益于探索青光眼的发病机制。DBA/2J小鼠模型的SHG成像发现MT破坏可引起SHG密度的衰减，且比MT厚度的衰减率高约97%，表明MT的破坏早于RGC轴突的丧失和纤维束形态或厚度的改变，为“MT青光眼假说”提供了支持[4]。SHG密度的降低使RGC轴突更易受到眼内压升高的影响，可敏感地检测轴突损伤，且SHG信号强度对MT装配的规律性高度敏感，故还可探测整个RNFL上不稳定的细胞骨架元件的结构完整性，可在RNFL变薄之前灵敏地发现青光眼的早期病变[31]。

4 总结和展望

SHG可用于获取离体组织和在体组织的成像。目前只有背向SHG可实现在体成像，但清晰度较差，限制了SHG技术的应用。随着SHG的发展和与其他成像技术的联合应用，SHG有望成为角膜扩张性疾病和角膜感染的临床检测手段，并用于角膜交联和屈光手术术后评估疗效和并发症的检查；在巩膜和视网膜上，对LC和RGC的成像研究有助于青光眼和视神经损害等疾病的发病机制的探索和治疗的评估，在疾病的早期诊断方面具有广阔应用前景。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明何欢欢：收集文献资料、分析；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行文章修改。高蓉蓉、黄锦海：参与选题设计；指导资料的分析和解释；对文章的知识性内容作批评性审阅和修改。王勤美：对论文的知识性内容作批评性审阅