A型塞内卡病毒检测方法研究进展

朱亭帆，钱金涵，王强，金文杰

(扬州大学兽医学院/江苏省动物预防医学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

A型塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)原名Seneca Valley virus(SVV)，是一种无包膜的单股正链RNA病毒，属于微RNA科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)[1]。SVA最初被确认为是一种细胞培养污染物[2]，但随后加拿大和美国研究人员发现其是猪水疱病(IVD)的病原体[1]。Knowles等[3]做了回顾性研究，发现SVA在美国猪群中实际存在已经超过30年。2014年之前，仅有少数关于SVA的报道，但是2015年之后，巴西[4]、中国[5]、越南[6]和泰国[7]等国家都报道了与SVA有关的IVD病例发病率的增加。SVA感染猪的病变以水疱形成和表皮糜烂为特征，发展为冠状血管带、口腔和鼻平面的溃疡，受影响的动物出现发烧和跛行[8]。此外，SVA也与新生仔猪死亡率的增加呈正相关[9]。虽然本病还没有大规模暴发，但是SVA引发的临床症状与口蹄疫病毒(FMDV)、猪水疱病病毒(SVDV)、猪水疱口炎病毒(VSV)、猪疱疹病毒(VESV)引起的水疱病不易区分，并且它是一种外来疾病，一旦暴发给养殖业带来的损失是不容小觑的。因此，对SVA快速有效的检测就显得尤为重要，本文就SVA的实验室检测方法进行综述。

1 病原鉴定

1.1 SVA的分离与鉴定

从患猪血清、粪便、扁桃体、口腔、水疱液等病料中成功进行病毒的分离培养和鉴定是诊断病毒感染的一般方法。可用于分离SVA的细胞系有很多种，其中包括人胚胎视网膜细胞(PER-C6)[2]、人肺癌细胞(NCI-H1299)[10]、人胚胎肾细胞(HEK293T)[11]、猪睾丸细胞(ST)[12]、幼龄仓鼠肾细胞(BHK-21)和猪肾细胞(PK-15)[13]。SVA感染可引起细胞病变，利用传统的细胞培养方法分离病毒可以为基于流行病学、血清学和抗病毒敏感性试验的研究提供基础。然而，用细胞培养进行病毒分离也有缺点，包括：需要较长的时间来诱导和观察细胞病变效应(CPE)；需要专业的技术知识；有时疑似被感染的样本数量过于庞大，对样本中是否有病毒存在的评估就会耗时耗力，所以通过细胞分离病毒进行SVA临床快速检测不是最佳方法。

1.2 原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)

ISH和IHC这2种方法分别用来鉴定组织样本中的特定病毒核酸和抗原。很多研究已经成功使用这2种技术来进行SVA相关疾病的诊断。ISH是一种在完整染色体内对特异性DNA片段定位技术，将标记的核酸探针与组织细胞中的待检测核酸特异结合，再用检测系统检测标记探针，同时显示核酸所在的位置。Joshi 等[8]将育肥猪经口鼻途径接种SVA株SD15-26，观察与SVA感染相关的临床症状和病变，并通过RT-qPCR和原位杂交(ISH)在第38天收集的组织中发现，所有感染了SVA的动物的扁桃体中都存在SVA RNA。随后，Resende 等[14]于2017年也开发了一种新的基于RNA的原位杂交技术(ISH-RNA)来检测感染组织中的SVA RNA。与经典原位杂交技术容易出现假阳性染色相比，新的ISH-RNA技术有较高的特异性，其极大地消除了这一限制，且与qRT-PCR技术的结合将会为猪SVA的诊断提供一种高灵敏度和特异性的方法。IHC是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的技术。Leme 等[15]对巴西不同地理区域的7个养猪场中由于皮肤、肠道和神经系统疾病而死亡的仔猪进行了研究，用针对SVA的单克隆抗体进行的IHC结果显示大脑脉络丛、舌头溃疡病变上皮、肾脏和膀胱的尿路上皮以及肠表面细胞有免疫反应。但是这种技术必须依赖于单克隆抗体，标记每一种特异性抗体只能检测一种抗原，敏感性较差，同时反应的信号也较小，特别是对于组织或细胞内微量抗原的检测。

1.3 病毒基因组检测

在所有的检测方法中，目前分子检测法被更多的用于SVA RNA的检测。因为这些方法不需要长时间的细胞培养，并且由于这些技术针对的是病毒的核酸，所以也不需要通过盲传来进行病毒的分离，最重要的是分子分析快速、特异和灵敏。因此，对一些在标准细胞系培养中不会增殖的病毒就可用此种方法进行检测。分子技术还可以分析出病毒的基因组特征或基因进化规律，这对于在特定时期或地理区域传播的新的野生型病毒株的识别至关重要。

1.3.1 PCR

PCR技术的广泛应用及适用性广使其成为世界各地实验室的常规方法，近年来研究人员建立了多种PCR法检测SVA，其中RT-PCR是一种快速确定动物是否急性感染病毒或水疱是否含有病毒的方法。Leme 等[4]设计了1套引物，用于RT-PCR扩增SVA基因组VP3/VP1区542 bp大小的产物。用RT-PCR对临床上患有水疱病猪的水疱液、拭子、破裂小泡等样品以及临床健康动物进行SVA检测。RT-PCR结果分析显示，上述所有采集的样本均扩增出542 bp大小的产物，即全部样品SVA呈阳性，而临床健康的猪均未检出该病毒。序列分析表明，该病毒与SVV-01原型株和其他北美分离的SVA株有很高的核苷酸(87.6%～98.5%)和氨基酸(95%～99.4%)的相似性。试验表明该引物适用于SVA的分子鉴定，提示SVA是猪群水疱病暴发的病原。但是RT-PCR的阴性结果却不能用来排除以前接触过病原的猪群，因为感染的临床症状通常在1～2周内就会消失。

1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

qRT-PCR具有更高的敏感性和特异性，可同时快速检测大批量样品。Bracht 等[16]通过扩增SVA VP1基因983 bp大小的片段，建立了一种灵敏的SYBR Green RT-qPCR检测方法，这种方法能够直接检测到不同水疱标本中的低水平SVA RNA，这些水疱标本包括蹄部病变组织、口腔和鼻部上皮、口腔拭子、肝脏、淋巴结。Agnol 等[17]、郭振华等[18]都通过扩增SVA VP1蛋白保守基因组区的片段，研究设计并建立了一种基于TaqMan的敏感而特异的qRT-PCR方法来检测和定量感染猪组织中的SVA。同样，张志等[19]以分离到的1株SVA流行病毒株GXT91作为参考毒株，设计合成了TaqMan探针和1对引物，并建立了SVA的荧光RT-PCR方法。樊晓旭等[20]针对病毒 3D基因区域分别设计引物和探针，建立的TaqMan荧光定量PCR最低检测灵敏度为 2.8 copies/μL，高于普通 PCR，批内、批间变异系数为1.73%～4.00%，具有良好的稳定性。与传统RT-PCR相比，该方法提供了一个高通量平台，通过将荧光标记的目标特异性探针与扩增过程相结合，实现了更高的灵敏度和特异性。但是qRT-PCR需要特殊的设备、昂贵的用品和熟练的工作人员，因此，这种技术并不能被广泛应用。

1.3.3 套式PCR

套式PCR是指利用2套PCR引物(套式引物)进行2轮PCR扩增反应。Feronato等[21]通过扩增SVA基因组中316 bp的VP1片段，建立1套套式PCR 方法。在37头仔猪中，RT-PCR和套式PCR 检测SVA的阳性率分别为15头(40.5%)和23头(62.2%)。结果表明，与常规RT-PCR相比，套式PCR 具有更高的灵敏度，反应效率更高、操作简单，是一种经济有效的诊断方法，特别是在常规RT-PCR中目标感染源的样本为阴性的情况下，或者是当细胞培养中的病毒分离不可用以及当必须对大量样本进行病毒检查时。由于套式PCR 反应有2次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的敏感性；又有2对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。该技术被建议用于流行病学研究中的病毒调查以及通过对猪群进行SVA的常规调查来进行健康监测。

1.3.4 环介导等温扩增(LAMP)技术

LAMP被认为是检测和鉴定病毒病原体的一种替代方法，特别是在那些实验室资源有限的地区。LAMP利用6个靶标特异性引物来扩增靶标中的8个区域病毒基因组，整个过程在60～65°C的恒温范围内一步完成，密闭管的性能还有助于防止污染，并满足简单性要求。杨钰楚等[22]根据SVA VP1基因序列，设计1套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP检测方法，该方法准确、简便、经济有效，尤其适用于现场和基层实验室对SVA的快速诊断。Zeng等[23]根据GenBank中已有的序列比对，选择针对VP2保守编码区的引物，建立实时RT-LAMP检测方法并与实时RT-PCR、常规RT-PCR的方法进行对比。实时RT-PCR和实时RT-LAMP检测结果证实SVA的患病率较高，分别为64.4%和71.2%，而常规RT-PCR检测SVA阳性率仅为34.7%，说明实时RT-LAMP和实时RT-PCR方法更优越，为实验室检测SVA提供了一种不依赖昂贵设备和仪器的新方法。

1.3.5 数字PCR(RT-ddPCR)

数字PCR(也可称单分子PCR)是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室，PCR 扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。Pinheiro-de-Oliveira等[24]基于RNA逆转录酶微滴数字PCR的诊断工具标准化，采用一步法和两步法，与RT- PCR、RT-qPCR(一步法和两步法)同时进行对生物样品中的SVA病毒核酸进行检测。结果表明，一步法不管是检测还是分析的特异性方面都优于两步法。此外，用单步分析方法对巴西SVA的生物学样本进行RT-ddPCR和RT-qPCR结果的一致性为94.2%。相较于RT-qPCR定量目标分子时需要高效的标准曲线，RT-ddPCR不需要参考曲线，具有很好的准确度和重现性。所以RT-ddPCR可以作为一种辅助诊断工具为随后SVA RNA的绝对定量分析打下良好的基础，同时也可以通过这种方法对猪水疱病进行有效的控制。

2 血清学检测方法

2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

血清中特异性抗体水平是鉴别病毒感染的有效指标。血清抗体测定在流行病学研究中对动物或人群免疫状态的确定具有重要意义。有研究表明，抗SVA VP1 蛋白抗体的测定可以作为检测SVA感染细胞的方法[13]。范慧等[25]以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原，建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法，且该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%，表明该方法重复性和稳定性均较好。Gimenez-Lirola等[26]通过每周对母猪和仔猪血清样本进行SVA VP1重组蛋白(rVP1)间接ELISA，评估其对SVA的血清学应答(IgG)。农作荣等[27]通过对SVA的衣壳蛋白VP1进行原核表达，并制备其多克隆抗体，结果表明，该多克隆抗体能跟SVA抗原特异性结合，为猪塞内卡病毒ELISA检测等其他方法的建立提供了良好的生物材料。Dvorak等[28]、申珊等[29]都曾以SVA的VP2蛋白建立一种间接ELISA方法，以此来鉴定血清中的SVA抗体，用来检测感染后一段时间内SVA抗体的存在和水平。但是SVA VP1 ELISA这种检测方法没有得到全面的验证，而基于SVA VP2的间接ELISA能快速、可靠地检测猪体内存在的SVA抗体。申水莹等[30]通过克隆SVA的VP3基因，将其与pQE-30表达载体连接，并进行原核表达，对表达的蛋白进行纯化和鉴定，用纯化的重组VP3蛋白(rVP3)作为包被抗原，通过矩阵法优化ELISA反应条件，建立检测SVA抗体的间接ELISA方法，经检测评估，该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。

竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)被广泛用于血清抗体的检测。该方法测定了在临床样本中存在的具有良好特征的单克隆抗体(mAb)之间的特异性抗原竞争。Yang等[31]在2012年率先使用纯化的病毒作为抗原制作出了单克隆抗体，使用点杂交试验，单克隆抗体的反应性被证实是特异性的。采用灭活的病毒抗原和单抗进行血清诊断，该试验建立了一种SVA特异性cELISA。与间接ELISA相比，cELISA很容易操作，并且可以进行放大以适应大量血清的筛选。

对于SVA的检测，OIE参考的cELISA具有0.45%的假阳性率，而在病毒中和试验(VNT)重新检测假阳性血清后可以进一步降低到0.1%～0.2%，虽然VNT法可以降低阳性率，但VNT法需要活病毒、细胞培养设施，至少需要3～4 d才能取得结果，这大大增加了控制疾病的成本，延缓了检测进度。所以Yang等[32]利用重组SVA病毒样颗粒(VLP)和SVA特异性mAb建立了一种ELISA方法，其与cELISA联合使用，为一种辅助诊断工具，减少阳性率。

2.2 间接免疫荧光(IFA)检测SVA

除了ELISA，IFA检测SVA IgG抗体已被广泛报道。 Houston等[33]为了确定SVA在美国非临床感染畜群中的血清效价，采用SVA rVP1 ELISA和SVA IFA检测SVA血清效价。结果表明这2种方法在畜群水平上表现出一致性，且发现SVA在美国养殖场是亚临床循环。该方法的优点是当 ELISA 检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时，可选用此法，即SVA rVP1的ELISA法和IFA的联合使用有助于猪场阳性猪的检出。

3 小结

2015年，由SVA引起的水疱病在我国广东省首次报告[34]。此后，黑龙江[10]、吉林[35]、福建[36]、河南[37]、海南[38]等省份都有此病毒的发现，这是一种对养猪业造成严重危害的新发传染病。虽然在中国SVA的暴发只是零星发生，但是其极有可能通过商业活动等传播到其他无SVA地区。如果不采取预防措施，就可能在不同区域之间快速传播。而众多研究人员已经开发出多种 SVA实验室诊断方法，以便在现场条件下进行早期诊断。对于病原检测，SVA病原的分离与鉴定、免疫组化和原位杂交、病毒基因组检测方法(RT-PCR、qRT-PCR、套式PCR、RT-LAMP、RT-ddPCR)在诊断中发挥重要作用，尤其是PCR、实时荧光定量 PCR、LAMP 等分子生物学技术更在猪感染SVA的早期即可检测到病毒核酸，在SVA的早期检测中具有重要作用；血清学方面，用免疫学方法检测抗体可以了解 SVA感染、发生、发展的进程，即有多种ELISA以及IFA的方法用于SVA检测。总之，SVA的实验室检测方法多种多样，各有优缺点，但是随着免疫学与分子生物学技术的不断发展，将开发出更多简单快速的检测技术应用于SVA的防控。