木犀草素对糖尿病性白内障大鼠的晶状体保护作用及对MEK/ERK信号通路的影响研究*

燕洁静，乔 瑛，王芬芬

（1.西安市第一医院眼科，西安 710002；2.西安医学院第一附属医院内分泌科，西安 710077）

糖尿病性白内障是糖尿病最常见的并发症之一，其发病机制尚不明确，国内外研究也尚未发现安全有效的用于治疗糖尿病性白内障的药物，目前临床中主要采用手术治疗等方式治疗[1]。由于手术治疗存在复发率高、术后不良反应多等缺点，所以，对于糖尿病性白内障的治疗药物开发任务仍十分艰巨。近年来研究发现，MEK/ERK 通路与糖尿病性白内障等糖尿病并发症密切相关[2-3]。木犀草素是从多种植物中提取得到的黄酮类天然化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[4]，近年来被证实其对糖尿病视网膜病变、糖尿病性白内障等多种疾病均具有显著作用[5-6]。本文通过研究木犀草素对糖尿病性白内障大鼠的晶状体保护作用及对MEK/ERK 通路的调节作用，旨在为木犀草素的药理作用研究及糖尿病性白内障药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

木犀草素(北京索莱宝科技有限公司，货号SL8300，纯度≥98%)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司，货号S0130，纯度≥98.5%)；MEK、ERK兔单克隆抗体(赛默飞世尔科技有限公司，货号13-3500、13-6200)；超敏ECL化学发光试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IGg、Beyozol(总RNA 抽提试剂)、BeyoRT™II cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)、实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒(碧云天生物科技有限公司，货号P0018、A0208、R0011、D7168、D7268)；苏木精－伊红（HE）染色试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司，AR1180-100)；逆转录试剂盒及PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技公司完成；WELLReader 全自动酶标仪(德国R-BIOPHARM)；KMC MICROTOME 手动轮转切片机(美国KOSTER)；Omega Fluor 凝胶成像系统凝胶成像仪(美国Aplegen)；BX63 自动荧光显微镜(日本Olympus)；TDL-5M 冷冻离心机(四川蜀科仪器有限公司)；ACCUCHEK Integra整合型血糖仪(瑞士罗氏公司)。

1.2 实验动物

Wistar 大鼠60 只，6 个月龄，雄性，体重200～240 g，购自(济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号[SCXK(鲁) 2019 0003]，饲养于动物房，实验前在裂隙灯下检查，排除基础眼部疾病。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、造模及给药 60只大鼠随机取12只作为正常对照组，其余大鼠腹腔注射STZ溶液(60 mg/kg)[7]，继续饲养4 周后测定血糖并在裂隙灯下检查晶状体及眼底，以大鼠血糖≥16.7 mmol/L且晶状体及眼底发生白内障病理性改变视为造模成功，并将大鼠随机分为白内障组和木犀草素低、中、高剂量组，12 只/组。木犀草素低、中、高剂量组分别按照20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg[8]灌胃给予大鼠木犀草素，正常对照组及白内障组给予生理盐水，1次/d，连续12周[9]。

1.3.2 血糖水平测定 末次给药24 h后，使用血糖仪经鼠尾静脉测定血糖水平，记为给药后大鼠血糖水平。

1.3.3 晶状体浑浊度检查及评分 使用托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙灯下检查晶状体浑浊度，参考文献[10]方法根据晶状体浑浊程度分为5级，并按照1～5 级标准分别记为0～4 分，按照公式计算大鼠晶状体浑浊度评分。大鼠晶状体浑浊度评分=分级评分×各分级大鼠只数/大鼠总数。

1.3.4 晶状体过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)水平测定

每组取6只大鼠，处死后取部分晶状体，在组织匀浆器中研磨匀浆后，8 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液，分别使用试剂盒采用钼酸铵化学比色法测定CAT 水平，紫外比色法测定GSH-Px 水平，WST-8法测定SOD水平。

1.3.5 晶状体病理学检查 每组取6 只大鼠，处死后取晶状体，固定于10%中性甲醛溶液中24 h，石蜡包埋后进行切片，厚度为5 μm，行常规HE染色。

1.3.6 晶状体MEK mRNA、ERK mRNA水平测定 每组取6 只大鼠晶状体，Beyozol 试剂提取总RNA 后逆转录为cDNA，按照定量试剂盒方法测定晶状体MEK mRNA、ERK mRNA 水平，以GAPDH为内参，结果采用2-ΔΔCt法计算。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.3.7 晶状体MEK、ERK蛋白水平测定 每组取6只大鼠晶状体，提取总蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯膜上，加入MEK、ERK及GAPDH兔单抗（1∶500）在4 ℃冰箱孵育过夜，然后在含吐温磷酸盐缓冲液中清洗30 min，经羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育后，滴加显影液，采用化学发光法并使用凝胶成像仪成像，量化分析蛋白水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所有数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠空腹血糖的影响

与正常对照组比较，白内障组及木犀草素低、中、高剂量组大鼠空腹血糖水平升高(P＜0.05)，给药前，木犀草素低、中、高剂量组大鼠空腹血糖水平与白内障组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；给药后，与白内障组比较，木犀草素各剂量组大鼠空腹血糖水平降低(P＜0.05)，见表2。

表2 木犀草素对大鼠血糖水平的影响

表2 木犀草素对大鼠血糖水平的影响

与正常对照组比较，aP＜0.05；与白内障组比较，bP＜0.05。

2.2 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠晶状体浑浊度的影响

与正常对照组比较，白内障组大鼠晶状体浑浊度评分升高(P＜0.05)，与白内障组比较，木犀草素低、中、高剂量组大鼠晶状体浑浊度评分显著降低(P＜0.05)，见表3。

表3 大鼠晶状体浑浊度评分 分，

表3 大鼠晶状体浑浊度评分 分，

与正常对照组比较，aP＜0.05；与白内障组比较，bP＜0.05。

2.3 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠晶状体CAT、GSH-Px、SOD水平的影响

与正常对照组比较，白内障组大鼠晶状体CAT、GSH-Px、SOD水平显著降低(P＜0.05)；与白内障组比较，木犀草素低、中、高剂量组大鼠晶状体CAT、GSH-Px、SOD水平升高(P＜0.05)，见表4。

表4 大鼠晶状体CAT、GSH-Px、SOD水平

表4 大鼠晶状体CAT、GSH-Px、SOD水平

与正常对照组比较，aP＜0.05；与白内障组比较，bP＜0.05。

2.4 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠晶状体病理学的影响

正常对照组大鼠晶状体未见明显病理改变，与正常对照组比较，白内障组大鼠晶状体皮质纤维紊乱，变性坏死，晶状体肿胀，提示造模成功；与正常对照组比较，木犀草素各剂量组大鼠晶状体病理学明显恢复，见图1。

2.5 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠晶状体MEK mRNA、ERK mRNA水平的影响

图1 大鼠晶状体HE检查结果(100×)

与正常对照组比较，白内障组大鼠晶状体MEK mRNA、ERK mRNA 水平升高(P＜0.05)，与白内障组比较，木犀草素低、中、高剂量组大鼠晶状体MEK mRNA、ERK mRNA水平降低(P＜0.05)，见表5。

2.6 木犀草素对糖尿病性白内障大鼠晶状体MEK、ERK蛋白水平的影响

与正常对照组比较，白内障组大鼠晶状体MEK、ERK 蛋白水平升高(P＜0.05)，与白内障组比较，木犀草素低、中、高剂量组大鼠晶状体MEK、ERK 蛋白水平降低(P＜0.05)，见图2。

表5 大鼠晶状体MEK、ERK mRNA水平

表5 大鼠晶状体MEK、ERK mRNA水平

与正常对照组比较，aP＜0.05；与白内障组比较，bP＜0.05。

图2 大鼠晶状体MEK、ERK蛋白水平

3 讨论

糖尿病性白内障是由于糖尿病患者血糖水平变化导致的血液渗透压改变，进而引发的晶状体功能及生理结构的病理性改变。目前研究认为糖尿病性白内障的发病机制与醛糖还原酶活性改变导致葡萄糖代谢等过程受阻有关，同时，维生素等微量元素的缺乏、紫外线暴露、缺氧等因素均是影响糖尿病性白内障发病的因素[11]。目前，国内外临床及药物研发体系均未发现有效治疗糖尿病白内障的药物，所以糖尿病白内障药物的研发仍是当前工作的重点。

木犀草素是来源于金银花、紫苏等多种植物中的天然黄酮类化合物，研究表明其对乳腺癌、结肠癌、呼吸系统感染、心肌细胞损伤等多种疾病均具有一定治疗作用[12-13]。近年来研究发现，木犀草素对视网膜病变等多种糖尿病并发症均具有较好的疗效，刘涛等[14]研究发现木犀草素能够显著抑制神经细胞凋亡，阻止糖尿病脑梗死大鼠疾病恶化；魏达亨等[15]研究报道木犀草素能够通过抑制炎症因子的释放减少视网膜色素上皮细胞损失，缓解碘酸钠诱导的视网膜损伤；周亚男等[16]研究发现，木犀草素能够通过升高视网膜SOD、Nrf2、HO-1等水平，进而抑制糖尿病大鼠视网膜病变进展；同时，Rooban等[6]研究发现木犀草素能够通过抑制晶状体氧化应激损伤，进而组织白内障的进展。由此可见，木犀草素在糖尿病性白内障治疗方面具有一定的潜力。

CAT是组织细胞内抗氧化系统中的重要成员，其能够分解体内过剩的过氧化氢进而防止细胞氧化损伤[17]；GSH-Px能够将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而避免过氧化物对细胞结构及功能的干扰及损害[18]；SOD 作为一种抗氧化金属酶，在机体氧化和抗氧化的平衡中扮演着重要角色[19]。赵晟等[20]研究表明，糖尿病性白内障患者体内CAT、GSH-Px 及SOD 水平较血糖水平正常的白内障患者明显降低，表明CAT、GSH-Px及SOD水平在糖尿病白内障的发病机制及新生血管病变中均起到关键作用；吴群等[21]报道了在糖尿病性白内障患者初始期、肿胀期、成熟期及过熟期等各个病情进展期，患者体内CAT、GSH-Px 及SOD 水平均降低，且CAT、GSH-Px及SOD水平随着病情进展而降低。本实验研究发现，与正常对照组大鼠比较，糖尿病性白内障大鼠晶状体CAT、GSH-Px 及SOD 水平降低，给予大鼠不同剂量的木犀草素后，与糖尿病性白内障大鼠比较，木犀草素各剂量组大鼠CAT、GSH-Px 及SOD 水平呈剂量依赖性显著升高(P＜0.05)，提示木犀草素能够呈剂量依赖性的缓解大鼠晶状体氧化损伤，进而缓解大鼠糖尿病性白内障进展。

MEK/ERK通路主要参与了细胞代谢及凋亡等过程，在外界炎症因子及病毒等多种刺激因子的作用下，MEK/ERK通路被激活，将信号从细胞表面转运到细胞核内，进而影响相关信号的传导。近年来研究发现，MEK/ERK 通路的异常激活与白内障等眼部疾病有关[22-23]。肖涵等[24]研究发现，在2型糖尿病性白内障大鼠体内ERK通路被过度激活，而抑制ERK 通路相关蛋白的过度激活则能够降低内质网应激，进而抑制白内障进展；阳辉等[25]研究发现，在糖尿病白内障模型大鼠体内MEK 通路被过度激活，二十二碳六烯酸能够缓解白内障大鼠晶状体状态，改善胰岛素抵抗系数，其机制可能与调节MEK通路有关；黄亚琳等[26]研究证实了MEK/ERK 通路的激活诱发白内障大鼠疾病进展，晶状体浑浊度升高，由此可见MEK/ERK 通路在糖尿病性白内障大鼠的发生发展中起到关键作用。本实验研究发现，与正常对照组比较，糖尿病性白内障大鼠晶状体MEK mRNA、ERK mRNA及蛋白水平升高，给予大鼠不同剂量木犀草素后，与白内障组比较，木犀草各剂量组大鼠晶状体MEK、ERK mRNA 及蛋白水平呈剂量依赖性明显降低(P＜0.05)，提示木犀草素能够呈剂量依赖性的抑制糖尿病性白内障大鼠MEK/ERK 通路的过度激活，进而改善了白内障的进展。

综上所述，木犀草素能够改善糖尿病性白内障大鼠的晶状体病理学变化，抑制晶状体氧化损伤，其机制可能与调节MEK/ERK信号通路有关。