新型冠状病毒肺炎患者外周血淋巴细胞亚群的分析研究

孟凡萍，郝 坡（.重庆三峡中心医院,重庆404000；.重庆三峡医药高等专科学校,重庆40000）

新型冠状病毒（novel coronavirus pneumonia，NCP）即“2019-nCOV”，因2019年武汉病毒性肺炎病例而被发现，于2020年1月12日被世界卫生组织命名。人群普遍易感，主要的传播途径是呼吸道飞沫传播和近距离接触传播。最新研究提示，有人从大便中分离出冠状病毒，因而可能还存在消化道等传播途径，粪便标本存在潜在的传染性,可能成为新的传播途径[1]。新型冠状病毒引起的肺炎叫新型冠状病毒肺炎，潜伏期3～7天，多低于14天，也有34天的个例。以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有流涕、腹泻等症状，重症患者多在一周出现呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合症。

因本课题组目前的工作主要负责万州片区新冠病毒的筛查，在日常检测中发现新冠病毒感染者可见淋巴细胞降低的现象。为进一步探讨淋巴细胞降低与新冠病毒感染的内在联系，课题组决定开展本研究。本研究对轻型和重型病患的淋巴细胞亚群进行分析研究，旨在为新型冠状病毒肺炎患者与其免疫系统之间的相互联系提供一些理论依据，并为其治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2020年2月于本院就诊的轻型冠状病毒肺炎患者（轻型组）35例、重型冠状病毒肺炎患者（重型组）11例，以健康体检者（NC组）20例为对照，年龄8个月～71岁，平均年龄52.3岁。所有病例均经过流行病学、临床表现及核酸检测确诊，排除其他呼吸道疾病及免疫性疾病，以及对本研究所涉及疾病有影响的其他疾病，患者亦未接受过免疫治疗。

1.2 仪器与试剂 Cobas Z480 荧光定量PCR 仪购自德国Cobas 公司，淋巴细胞亚群分析试剂盒、BD FAS CALIBUR 流式细胞分析仪以及FCAP CELLQUEST 分析软件为美国BD 公司产品，病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）及GeneRotex96 核酸提取仪为西安天隆科技有限公司产品，新型冠状病毒2019-nCOV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）为湖南圣湘生物科技有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 2019-nCOV 核酸的提取：将病人样本（咽拭子、鼻拭子、肛拭子等）置于56℃孵箱中30min 灭活后，取200μl 拭子洗液加入到试剂板中，放入核酸提取仪中，经裂解、洗涤、洗脱，进行自动化提取2019-nCOV RNA。

1.3.2 荧光定量PCR：将提取的病毒RNA 加入到PCR 反应液中，在荧光定量PCR 仪上检测。选择FAM 通道检测2019-nCOV ORF-lab 区域，ROX 通道检测2019-nCOV N 基因，HEX 通道检测内标。PCR反应程序：50℃ 30min；95℃ 1min；95℃15s，60℃ 30s，45 cycles；25℃ 10s。Ct≤40 判断为阳性。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）测定：PCR 操作、反应过程及结果判定按照标准操作程序进行，并设立阳性质控品和阴性对照，共同进行检测和分析。

1.3.3 流式细胞检测淋巴细胞亚群变化：用CD3+（PE 标记）和CD4+（PerCP 标记）、CD8+（FITC标记）分别设门，分别圈出辅助性T细胞和细胞毒性T细胞，用CD22+（FITC 标记）和CD3+（PE 标记）设门，圈出B细胞，用CD3+（PE 标记）和CD56+（PerCP 标记）设门，圈出NK细胞，用CD3+（PE标记）设门，圈出淋巴细胞。通过对数据进行采集和分析，计算淋巴细胞总数、T淋巴细胞数及比例、B淋巴细胞数及比例、NK细胞数及比例、CD4+T细胞数及比例、CD8+T细胞数及比例，以及CD4+/CD8+比值。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，三组间的均数比较采用单因素方差分析，两组间的均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 核酸检测 35例轻症患者和11例重症患者和20例健康体检者的核酸分别进行ORF-lab 基因和N基因的阳性检测。经检测，35例轻症患者和11例重症患者的两个基因均为阳性，而20例健康体检者两个基因均为阴性。

2.2 淋巴细胞亚群分析 见表1。两组患者的淋巴细胞总数、T淋巴细胞数（比例）、CD4+T细胞数（比例）、CD8+T细胞数（比例）、B淋巴细胞数（比例）、NK细胞数（比例）的差异均有统计学意义（均P<0.05），且重症组比轻症组降低的更为显著，差异具有统计学意义（P<0.05）；两组患者的CD8+T细胞数和CD4+/CD8+较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05），但轻症组与重症组差异不明显，无统计学意义（P>0.05）；两组患者B淋巴细胞比例较对照组显著升高（P<0.05），且重症组明显高于轻症组（P<0.05），差异均有统计学意义；NK细胞比例在重症组可见明显升高（P<0.05），而在轻症组和对照组则差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 三组淋巴细胞亚群检测结果分析（±s）

表1 三组淋巴细胞亚群检测结果分析（±s）

项 目 轻症组 重症组 对照组 轻症组 vs 对照组 重症组 vs 轻症组t P t P总淋巴细胞数（cell/L） 1 049±493 609±279 2 115±311 0.121 0.010-0.307 0.031 T淋巴细胞数（cell/L） 739±388 399.45±236.06 1 447±209 0.511 0.012 0.536 0.041 T淋巴细胞比例（%） 68.97±12.68 59.62±16.9 79.4±17.4 0.029 0.009 1.208 0.021 CD4+T（cell/L） 388.75±208.16 208.82±111.37 782±249-1.201 0.020 1.036 0.020 CD4+T/总淋巴细胞（%） 37.77±9.52 32.73±9.33 40.0±12.44-0.774 0.006-0.852 0.030 CD8+T（cell/L） 263.75±131.66 194.19±154.26 631±41 0.045 0.001-0.043 0.062 CD8+T/总淋巴细胞（%） 27.98±8.94 27.12±13.12 24.2±12.49 0.632 0.005 0.129 0.070 CD4+/CD8+ 1.47±0.6 1.5±0.84 1.24±0.19-0.142 0.005 0.256 0.112 B淋巴细胞数（cell/L） 172±106 110.36±51.75 322±65 0.065 0.020-0.744 0.011 B淋巴细胞比例（%） 18.98±8.23 21.82±11.6 12.9±5.3-0.352 0.013-0.114 0.016 NK细胞数（cell/L） 135.75±92.1 89.72±79.68 315±41 0.201 0.021 0.059 0.098 NK细胞比例（%） 12.19±10.0 16.68±10.58 12.7±14.9 0.105 0.151 0.066 0.011

3 讨论

2019新型冠状病毒（2019-nCoV）是2019 新型冠状病毒性肺炎的病原体，感染病毒的人会出现程度不同的症状，轻症有发烧或咳嗽症状，重度会发展为肺炎，更严重可导致死亡[2-3]。2020年1月30日，世界卫生组织发布新型冠状病毒感染肺炎疫情为国际关注的突发公共卫生事件，3月11日，世界卫生组织总干事谭德赛宣布，新型冠状病毒已构成全球大流行。新型冠状病毒主要的传播途径是呼吸道飞沫传播和接触传播。各个年龄段的人都可能被感染，其中老年人和体弱多病的人更容易被感染。

2020年1月24日，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所成功分离了我国第一株病毒，同时发布了毒种信息、病毒在电镜下的形态、核酸检测引物和探针序列重要权威信息[4-7］，对病毒有了一定的认识。研究发现，新冠病毒的刺突蛋白结构与中东呼吸综合征（MERS 病毒）和“非典”（SARS病毒）的刺突蛋白结构非常相近，并已确认SARS病毒的中和抗体可与新冠病毒蛋白相结合[8]。

华中科技大学团队率先完成了9例新冠肺炎死者遗体的病理解剖工作。他们发现，新冠病毒不仅损害感染者的肺脏，而且还损害感染者的免疫系统及其他组织器官。有学者对新冠病毒患者不同病情状态下淋巴细胞、白细胞介素-6 及炎症指标的变化及淋巴细胞亚群与CT 肺炎影像指数的相关性进行研究，发现不同程度的重症患者的IL-6 与CRP水平均显著高于轻症患者(P<0.01)，呼吸困难越严重的患者，其淋巴细胞计数、T淋巴细胞数、B淋巴细胞数、CD4+T 和CD8+T水平越低，且不同程度重症患者与轻症患者均有显著差异（P<0.05）；症状越严重的患者其淋巴细胞比率越低，故IL-6，淋巴细胞亚群、CRP 等指标能预测新型冠状病毒肺炎患者的病情变化，新冠肺炎患者T淋巴细胞数值越低，CT 显示肺部炎症越严重，病情越严重[9-11]。有研究在对重型和危重型新型冠状病毒肺炎患者外周血淋巴细胞计数和淋巴细胞亚群进行分析，发现重型组、危重组的淋巴细胞计数、T淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞计数、CD8+T淋巴细胞计数和B淋巴细胞计数均低于普通组，差异具有统计学意义（P<0.05），而危重组的淋巴细胞计数、T淋巴细胞计数、CD4+T淋巴细胞计数和NK细胞计数低于重型组，差异具有统计学意义（P<0.05），反映了COVID-19患者机体免疫系统受损及其严重程度[12-13]。许娇等[14]在对不同临床分型的COVID-19患者的外周血淋巴细胞分析发现，COVID-19患者外周血淋巴细胞数量降低,且重症患者的淋巴细胞水平显著低于轻症患者。王琳琳等[15]发现新冠组患者外周血中WBC 计数，Neu 计数及NLR值均低于甲流组，差异具有统计学意义。淋巴细胞计数低于健康组，差异具有统计学意义。外周血细胞检测中WBC 计数、Neu 计数、Lym 计数及NLR值指标可用于辅助鉴别COVID-19患者、甲流患者、健康人群，对COVID-19 诊断有一定临床意义。

本课题的主要研究目的就是了解新型冠状病毒对患者外周血淋巴细胞亚群的影响。研究发现，轻症和重症患者的淋巴细胞总数、T淋巴细胞数（比例）、CD4+T细胞数（比例）、CD8+T细胞数（比例）、B淋巴细胞数（比例）、NK细胞数（比例）的差异均有统计学意义（P<0.05），且重症组比轻症组降低的更为显著，差异具有统计学意义（P<0.05）。两组患者的CD8+T细胞数和CD4+/CD8+较对照组有所升高（P<0.05），但轻症组与重症组组间差异不明显，无统计学意义（P>0.05）。两组患者B淋巴细胞比例较对照组显著升高（P<0.05），且重症组明显高于轻症组（P<0.05），差异均有统计学意义。NK细胞比例在重症组可见明显升高（P<0.05），而在轻症组和对照组则差异无统计学意义（P>0.05）。

综合近期发表的新冠病毒对感染者淋巴细胞和免疫功能相关文献及本课题的研究结果，充分说明新型冠状病毒对患者的免疫系统影响比较复杂，不仅存在免疫功能紊乱，还存在一定的免疫缺陷，甚至是免疫监视水平的变化，尤其是对机体细胞免疫水平影响较大，主要表现为淋巴细胞总数、淋巴细胞亚群数量和比例下降，导致机体免疫功能降低，尤其是细胞免疫功能降低，可以肯定新型冠状病毒肺炎改变了患者的免疫功能和免疫状态，研究其免疫功能的变化对于新冠肺炎的治疗具有重要价值。