液相芯片技术快速检测2型糖尿病患者相关降糖药物基因多态性的方法学建立

邓任堂，许红丽，孔桂兴，赖丽莎，揭育帮，陈梅莲，付文金（.广东省东莞市厚街医院检验科，广东东莞 53945；.湖南省武冈市人民医院检验科，湖南邵阳 4400）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是严重影响人类身心健康的重大疾病之一。对于确诊患者，最有效的治疗方法就是药物降糖治疗。然而，不同的T2DM患者在使用降糖药治疗过程中，在药代动力学、疗效以及不良反应中存在显著的个体差异，这是药物基因组学导致的，其中磺脲类受体1(sulfonylurea receptor 1，ABCC8)[1]，转录因子7 类似物2(transcription factor 7～like 2，TCF7L2)[2-3]，胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate～1，IRS1)[4-5]，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxidase proliferation of activated receptor～γ2,PPARγ2）[6]，有机阳离子转运蛋白与多药和有毒化合物排出家族(organic cation transporters and multidrug and toxin extrusion proteins，SLC47A1,SLC22A1)[7]，有机阴离子转运蛋白家族成员1B1(Organic Anion Transporters 1B1，SLCO1B1)[8-10]等有重要临床意义。但目前常用检测单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）的方法并不能很好地满足临床需求。液相芯片技术作为新一代高通量检测技术，特别适用于SNPs检测，在临床各方面发挥越来越重要的作用。本研究旨以液相芯片技术，通过多重PCR 联合等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE），建立一次性检测上述7个目标基因型的方法，以期为临床选择适宜降糖药，减少不良反应，提高药效提供实验室支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 115例患者为2019年1～12月我院新诊2型糖尿病患者，均符合WHO 颁布的糖尿病诊断标准，其中男性63例，女性52例，年龄52～76岁，中位年龄65岁。所有患者均签署知情同意书，并通过东莞市厚街医院伦理委员会批准，厚街伦理编号：[2019]伦审第(023)号。

1.2 试剂和仪器 多重PCR 试剂盒TaqTMHot Start Version（日 本TaKaRa 公司），DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司），核酸外酶I～虾碱性磷酸酶（ExoSAP～I）,PlatinumTM GenoType Tsp DNA聚合酶、链霉亲和素-澡红蛋白（SA～PE）,Biotin～dCTP，dNTPs等（美国赛默飞世尔科技公司），偶合Anti-Tag 序列微球（美国Luminex 公司），LifeECO 基因扩增仪（中国透景生命科技有限公司），蛋白核酸分析仪（英国豪沃生物科技有限公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与DNA 提取：采用EDTA-K2抗凝管采集患者空腹外周血2ml，按照试剂盒说明书提取DNA，使用蛋白核酸分析仪调整样本DNA浓度至25～30 ng/μl。

1.3.2 引物设计及合成：参照课题组之前做法[11]，根据7个目的基因的rs号，在Genbank 中查找其靶位点附近碱基序列，以PrimerPlex 软件设计特异性的ASPE 引物，Primer6.0 软件设计含检测位点的PCR 引物。委托上海生工生物技术有限公司合成所有引物。引物及微球信息见表1。

1.3.3 多重PCR系统：反应总体系共50μl，其中含DNA样本2μl，5 U/μl TaqTMHot Star DNA 聚合酶 0.25μl，10xTaqTMHot Star DNA 聚合酶缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 4μl，上下游混合引物8μl，超纯水30.75μl。混合物先3 000×g 离心10s，94℃预变性30s 后，94℃30s，57℃30s，72℃30s，5个循环；接着94℃ 30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃10 min 终止延伸。同时以超纯水作空白对照。

1.3.4 PCR 产物纯化：取PCR 扩增产物5μl 与ExoSAP-IT 2.5μl 混合，37℃孵育30min，80℃反应20 min。

1.3.5 ASPE 反应：反应总体系20μl，含纯化PCR 扩增产物2μl，TAG-ASPE 引物混合液1μl，400μmol/L Biotin-dCTP 0.3μl，300μmol/L dATP/dGTP/dTTP 混合液1μl，10×TaqTMHot Star DNA聚合酶缓冲液2μl，5U/μl TaqTMHot Start DNA聚合酶0.12μl，100μmol/L dCTP 0.4μl，超纯水13.18μl。混合物先3 000×g 离心10s，接着94℃30s，55℃30s，74℃1min，40个循环。

1.3.6 杂交反应：以1.5×四甲基氯化氨（tetramethylammonium chloride，TMAC）杂交缓冲液混合14种MagPlex-TAG 微球，并稀释至每种微球约50个/μl。取上述混合液25μl 与ASPE 反应产物2μl 混合，先96℃90s，37℃45min，然后加入100μl 含7.5μg/ml SA-PE的1×TMAC杂交缓冲液，经37℃孵育20 min 后，以Luminex 200检测荧光信号。

表1 7个目的基因的相关引物及微球信息

1.3.7 结果判读与基因分型：Luminex 200检测系统可直接输出MFI 和MFI 比率。MFI 比率=MFI目标碱基/（MFI野生型+MFI突变型）。MFI 比率>0.75或<0.25 判为野生型或突变纯合子，而0.25～0.75则判为杂合子。

1.3.8 多重PCR 及ASPE 反应条件优化：多重PCR优化：依引物Tm值选择50～60℃梯度退火温度，分别检测100，50，25，12.5 和6ng DNA浓度样本，根据扩增产物电泳结果对7 对引物间的比例、循环次数、退火时间及Mg2+/dNTP/Taq浓度等进行调整。ASPE 反应条件优化：根据MFI 和MFI 比率结果，调整ASPE 反应体系中退火温度及Biotion-dCTP，dCTP浓度等。

1.3.9 方法学性能评价：①重复性实验：参照李婧婵等[12]方法，用五份代表性样本进行批内和批间重复性实验。②最低检测限：参照PICKERING 等[13]方法，以DNA浓度200 ng为基础，倍比稀释至0.75ng，对各浓度样本重复检测三次，以三次均能清晰分辨基因型所对应的浓度为最低检测限。③特异性试验：参照李婧婵等[12]方法，不同的单个靶位点PCR 扩增产物分别与另外的ASPE 引物进行混合，检测信号的特异性。④准确性实验：选择25份样本，分别用本实验建立的方法和Sanger 测序法进行检测，两者结果对比分析。

表2 5份标本等位基因MFI 及MFI 比率 [n（%）]

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用非配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 方法学建立 7个目标基因经PCR 扩增，产物电泳成像后清楚可见七条目标条带，无非特异性条带；经优化ASPE 杂交条件，选择退火温度55℃，Biotion-dCTP浓度与dCTP浓度的比值为3∶1，37℃孵育45 min时检测效果最佳。

2.2 方法学性能评价 采用本实验方法检测倍比稀释标本，最低检测限可达0.75ng，以DNA浓度为50ng时分辨率最高。表2反映5份样本MFI 及MFI比率结果。从重复性实验结果来看，MFI 批内批间CV偏高，分别达26.3%和33.7%；但纯合子MFI比率批内批间CV在0.9%～3.3%和2.1%～4.6%；杂合子MFI 比率批内批间CV在2.9%～7.3%和5.2%～11.2%。结果见表3。特异性试验结果显示不含靶位点时MFI值均小于250，含靶位点MFI值可高达1 000以上。以本实验方法检测25份样本，与测序结果完全一致，准确度达100%。

表3 5份标本相关基因型批内批间MFI，MFI 比率及CV值

3 讨论

2型糖尿病是全球性的公共卫生问题。我国糖尿病患者已超过1亿，是糖尿病第一大国。对于确诊T2DM患者，最有效的治疗方法就是药物降糖治疗。临床常用口服降糖药物主要包括磺脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、氯苯茴酸类和α 葡萄糖苷酶抑制剂类。研究已证实药物基因组学可导致不同患者使用降糖药治疗时，在药代动力学、疗效以及不良反应中存在显著的个体差异。相关研究已筛选出几十个与药物治疗反应相关的基因位点，其中ABCC8，TCF7L2，IRS1，PPARγ2，SLC47A1,SLC22A1 和SLCO1B1 等有重要临床意义。

目前，检测基因多肽性的方法主要有：固相芯片法、PCR 法、测序法等，但这些方法通量低，成本高，耗时长、敏感度和特异度低，操作复杂，或需特殊仪器，从而限制其应用[14]。液相芯片技术为新一代高通量检测技术，操作简便、灵敏度高、重复性好，特别适用于SNPs检测，在临床各个领域应用越来越多。本研究以 Luminex 200为平台，成功建立了高效便捷检测2型糖尿病降糖药相关药物基因型的方法，本方法灵敏度、重复性、特异性及准确性均较理想，有望为临床选择适宜口服降糖药，减少不良反应，提高药效提供实验室支持。

影响Luminex 液相芯片方法学建立的因素较多，关键在于多重PCR 反应体系，ASPE 杂交条件等。（1）在构建多重PCR 反应体系时，为保证扩增的特异性，要重点关注两个指标：①各引物间Tm 差值。为避免各目的基因之间发生非特异性扩增，在设计PCR 引物时尽可能的减少各引物间Tm差值。本试验中各引物间Tm 差值小于2℃；②退火温度，退火温度决定PCR 特异性，退火温度高特异性强，退火温度低则非特异性产物增加，合理的退火温度从55℃～70℃。本试验从50℃开始探索，直到将前5个PCR 循环退火温度设为57℃时，取得较好效果。（2）在摸索ASPE 杂交条件时，首先，要避免ASPE 引物之间发生交叉延伸，这可通过调整多重PCR 延伸温度得以解决。其次，ASPE 反应体系中Biotion-dCTP浓度与dCTP浓度比值至关重要。我们在上一课题中已发现，该比值过高会影响ASPE 引物有效延伸，过低则荧光信号弱，维持在3：1 可取得较好效果[11,15]。

方法学评价结果表明：本方法灵敏度高，最低检测限达0.75ng；特异度强，设计的ASPE 引物探针与其他位点均无交叉反应；准确性高，25份样本检测结果与测序结果完全一致，基本可满足临床需求。

本研究也有一定的局限性，本次研究只收集了115份临床标本进行实验，属小标本研究事件，同时MFI的批内批间CV值达26.3%和33.7%，课题组将继续收集临床标本，对系统参数进行调整优化，以解决CV值偏高的问题，进一步在大样本层面验证，以期临床应用。

综上所述，本研究成功建立了液相芯片检测系统，可高效便捷检测7个2型糖尿病降糖药相关药物基因型，满足临床的需求，有望为临床选择适宜降糖药，减少不良反应，提高药效提供实验室支持。